核酸的物化性质

核酸的物化性质第一页，共四十一页，编辑于2023年，星期一一、核酸的水解核酸分子中的N-糖苷键和磷酸酯键都可被水解。（一）核酸的酸解糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解，水解的难易顺序为：磷酸酯键>糖苷键嘧啶碱的糖苷键>嘌呤碱的糖苷键嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键最易水解。如，DNA在pH1.6于37℃对水透析即可完全除去嘌呤碱，。嘧啶糖苷键的水解常需要较高的温度。用甲酸（98％-100%）密封加热至175℃2h，无论RNA或DNA都可以完全水解，产生嘌呤和嘧啶碱。第二页，共四十一页，编辑于2023年，星期一（二）核酸的碱解常用的碱有NaOH、KOH等，主要水解磷酸酯键。以KOH效果最好。RNA较易被碱水解。例如，在0.3-1mol/LNaOH溶液中，在室温至370C条件下RNA几乎可以完全水解，生成2′-或3′-核苷酸，还可能有少量的核苷、2′,5′-或3′,5′-核苷二磷酸。DNA在较难被碱水解。DNA在1mol/LNaOH溶液中，加温至1000C，4个小时也可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2′-OH参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。第三页，共四十一页，编辑于2023年，星期一第四页，共四十一页，编辑于2023年，星期一（三）核酸的酶解核糖核酸酶T2（RNaseT2）。这个酶的来源同RNaseT1，主要作用点为Ap残基，可以将tRNA完全降解成3´-腺苷酸结尾的寡核苷酸。第五页，共四十一页，编辑于2023年，星期一牛脾核糖核酸酶的作用位点核糖核酸酶T1的作用位点第六页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

链球菌脱氧核糖核酸酶，是一个内切酶，作用于DNA产物为5´-磷酸为末端的碎片，其长度不一。限制性内切酶，在细菌中发现有这类酶，主要是降解外源的DNA。具有很严格的碱基序列专一性，是基因工程最重要的工具酶。第七页，共四十一页，编辑于2023年，星期一第八页，共四十一页，编辑于2023年，星期一第九页，共四十一页，编辑于2023年，星期一三、核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm之间有强吸收峰，在260nm左右有最大吸收峰。可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据。对于纯的DNA或RNA，可测定A260

双螺旋DNA含量（μg/mL）=A26050

单链DNA含量（μg/mL）=A26040

寡核苷酸含量（μg/mL）=A26020

纯度的判断：测定A260/A280的比值，纯DNA比值>1.8

纯RNA比值≥2.0第十页，共四十一页，编辑于2023年，星期一有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。据此先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光系数ε（P）。增色效应——当双链核酸变性转变为单链核酸时，其在260nm的紫外吸收值增加，ε（P）值也升高，这种现象称为增色效应。减色效应——当单链核酸复性转变为双链核酸时，其在260nm的紫外吸收值减少，ε（P）值也降低，这种现象称为减色效应。第十一页，共四十一页，编辑于2023年，星期一四．核酸的变性、复性与杂交（一）核酸的变性（denaturation）核酸的变性——指核酸双螺旋区的碱基之间的氢键断裂，变成单链的过程。能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显。利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。因为天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260nm)值增加25－40%.而RNA变性后，约增加1.1%。第十二页，共四十一页，编辑于2023年，星期一A260值增加粘度下降浮力密度增大分子量不变DNA变性后的表现第十三页，共四十一页，编辑于2023年，星期一DNA的热变性和解链温度（Tm）用加热的方法使核酸变性叫做热变性。DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为DNA熔解温度或熔点，用Tm

表示。一般DNA的Tm值在82-95C之间。RNA的Tm值tRNA的Tm值第十四页，共四十一页，编辑于2023年，星期一DNATm的影响因素：（1）DNA的均一性。均质DNA，如一些病毒DNA，人工合成的poly(A-T)、poly(G-C)的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质DNA的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。Tm大小可反映出DNA的均一性。第十五页，共四十一页，编辑于2023年，星期一（2）G-C的含量。G-C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G、C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)2.44第十六页，共四十一页，编辑于2023年，星期一（3）介质中的离子强度。Tm与介质中离子强度有关，一般来说，在离子强度低的介质中，DNA的Tm值较低，熔解的范围较宽。在离子强度高的介质中，DNA的Tm值较高，熔解的范围较窄。DNA的保存应在含盐的缓冲液中第十七页，共四十一页，编辑于2023年，星期一RNA的变性第十八页，共四十一页，编辑于2023年，星期一（二）核酸的复性变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火（annealing)。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。复性反应的速度用Cot1/2表示。Co为变性DNA复性时的浓度，t为时间，以秒表示。第十九页，共四十一页，编辑于2023年，星期一DNA复性第二十页，共四十一页，编辑于2023年，星期一（三）核酸的杂交（hybridization）热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。第二十一页，共四十一页，编辑于2023年，星期一第二十二页，共四十一页，编辑于2023年，星期一第二十三页，共四十一页，编辑于2023年，星期一第二十四页，共四十一页，编辑于2023年，星期一第二十五页，共四十一页，编辑于2023年，星期一Southernblotting(Southern印迹)Northernblotting(Northern印迹)Westernblotting(Western印迹)第二十六页，共四十一页，编辑于2023年，星期一第15章核酸的研究方法一、核酸的分离、提纯和定量（一）DNA的分离1、染色体DNA与碱性蛋白（组蛋白）结合成的核蛋白（DNP）沉淀真核细胞破碎1mol/L氯化钠提取稀释至0.14mol/L加水饱和的苯酚，振荡冷冻离心水相（含DNA）酚相（含蛋白质）加2倍体积冷乙醇纯DNA第二十七页，共四十一页，编辑于2023年，星期一2、用氯仿-辛醇（或异戊醇）代替苯酚，方法同165℃保温4h真核细胞悬液加入2倍体积含1%SDS的缓冲液和广谱蛋白酶加苯酚抽提分离水相（含DNA和少量RNA）酚相（含蛋白质和酶）加RNA酶纯DNA3、4、氯化铯密度梯度离心第二十八页，共四十一页，编辑于2023年，星期一（二）第二十九页，共四十一页，编辑于2023年，星期一（三）第三十页，共四十一页，编辑于2023年，星期一第三十一页，共四十一页，编辑于2023年，星期一第三十二页，共四十一页，编辑于2023年，星期一第三十三页，共四十一页，编辑于20