水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病人工接种鉴定技术规范

水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病人工接种鉴定技术规范范围本文件界定了水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病（病原：南方水稻黑条矮缩病毒，Southernriceblack-streakeddwarfvirus，SRBSDV）人工接种鉴定所涉及的术语和定义，规定了人工接种鉴定和抗病性评价的要求。本文件适用于水稻品种及育种材料抗南方水稻黑条矮缩病性状的鉴定与评价。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T2631—2014南方水稻黑条矮缩病测报技术规范术语和定义下列术语和定义适用于本文件。南方水稻黑条矮缩病southernriceblack-streakeddwarfdisease由南方水稻黑条矮缩病毒（Southernriceblack-streakeddwarfvirus，SRBSDV）侵染引起的水稻病毒病。

病株infectedplants表现南方水稻黑条矮缩病症状的水稻植株（病害鉴定调查标准见4.4.2）。

发病率rateofinfectedplants病株占调查水稻总植株数的百分率。

无毒白背飞虱non-viruliferouswhite-backedplanthopper不携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱（Sogatellafurcifera

（Horváth））。人工接种鉴定接种用白背飞虱的准备白背飞虱的采集和饲养白背飞虱若虫或成虫采集自田间，在养虫室内用感虫水稻品种TN1连续饲养。养虫室条件为：温度（26±1）℃，相对湿度80％～90％，光照L:D=12h:12h。无毒白背飞虱群体的获得选取白背飞虱喜食的水稻种子（如TN1）用水浸种24h后，纱布覆盖，恒温箱（32±2）℃催芽（24h～48h），选取发芽良好的种子25～30粒均匀播于盛有自然肥力土壤的塑料杯中（内径80mm～110mm）；6d～7d后，待苗长至1.5叶期时，将怀卵的单头白背飞虱雌成虫移入杯中产卵，3d后取出成虫，立即进行带毒性检测或置于小型容器中-20℃保存待检。稻苗继续培养7d～10d，孵化出白背飞虱后代若虫群体，每群体取10～20头2龄或3龄若虫进行带毒性检测。白背飞虱带毒性检测按NY/T

2631—2014中附录C的规定进行，产卵成虫及其后代若虫均不带毒的群体定义为无毒白背飞虱群体。毒源准备病株采集田间采集表现南方水稻黑条矮缩病疑似症状的分蘖期水稻植株种植在防虫网笼中的塑料桶中。病株检测确定采病株叶片按NY/T

2631—2014中附录C的规定或参见本文件附录A进行检测，确认感染南方水稻黑条矮缩病毒则作为毒源保存在防虫笼中。病株纯化扩繁隔离条件下白背飞虱在4.2.2病株上饲毒后接种水稻秧苗，纯化并扩繁病株。接种鉴定参鉴水稻苗的准备参鉴品种（含感病对照TN1）经4.1.2方法浸种、催芽；选取30粒发芽良好的种子均匀播于盛有自然肥力土壤的塑料杯（内径80mm～110mm）中，每品种重复3次。白背飞虱饲毒将经检测确定感染SRBSDV的病株种于大烧杯（内径100mm～200mm）中，土面覆盖滤纸，将适量1～2龄无毒白背飞虱移入其中，并用60目防虫网封口。饲毒2d后将虫移入塑料杯（内径80mm～110mm，预先育有白背飞虱喜食品种如TN1的秧苗）中饲养，度过循回期（11d）后，每批随机取出30头白背飞虱高龄若虫或成虫，按NY/T

2631—2014中

附录C的规定检测白背飞虱群体带毒情况，计算白背飞虱群体的带毒率。接种方法选取4.3.2已饲毒且度过循回期的白背飞虱成虫接种群体，从接种群体中随机抽取50头以上虫，测定带毒率，计算接虫数量后接入已育有参鉴品种的塑料杯（内径80mm～110mm）中，接种苗龄为1.5～2.5叶龄期，接种时间为2d，接种温度（26±1）℃，且每天上午和下午各赶虫一次，使白背飞虱分布均匀，2d后用杀虫剂将接种用白背飞虱全部扑杀，将秧苗移出塑料杯，种植在防虫网室水泥池中，至20℃～35℃条件下培育，常规管理，定期观察植株发病情况。人工接种鉴定的有效接种虫量用IVS表示，数值以头/苗计，按公式（1）计算。 IVS=N×PVS （AUTONUM）式中：IVS——人工接种鉴定的有效接种虫量；N——接种白背飞虱数量；PVS——白背飞虱带毒率。当IVS值处于1头/株～2头/株范围内，方可认为试验有效。调查调查时间接种20d后调查发病情况，同时确定有效鉴定株数，之后每隔7d调查一次，共调查3次。调查标准苗期发病症状：秧苗叶色浓绿，叶片短小僵直，心叶扭曲，或现锯齿叶；植株矮化不明显，叶背沿叶脉有纵向不规则蜡白色瘤状突起，后变黑褐色；植株矮小，叶色稍浓绿。出现4.4.2.1中a）或b）症状的植物直接记为病株；出现4.4.2.1中c）症状的植株按NY/T

2631—2014中附录C的规定或参见本文件附录A进行检测确认。发病率计算根据感病对照3次调查的最高发病率确定待鉴品种发病率的计算方式，感病对照3个重复三次调查中的最高发病率均超过30％，则认定本次鉴定有效；若参鉴品种3个重复三次调查中的最高抗性级别差异均不超过1个等级，则认定本次鉴定准确。在鉴定有效且准确的前提下，取3个重复三次调查中的最高发病率确定品种的抗性级别。若出现感病对照的最高发病率小于30％，则认定本次鉴XX果无效。发病率用Ri表示，数值以％计，按公式（2）计算。 Ri=ni/n式中：Ri——发病率；ni——病株数；nt——总株数。计算结果精确到小数点后两位。抗病性评价抗性分级标准抗性分级标准如下：0级，发病率为0，免疫；1级，发病率为0.01％～5.00％，抗病；3级，发病率为5.01％～15.00％，中抗；5级，发病率为15.01％～30.00％，中感；7级，发病率为30.01％～50.00％，感病；9级，发病率大于50.00％，高感。抗性评价当品种抗性在不同地区间、不同年度间或批次间鉴XX果表现不一致时，抗性结果为其中的最差等级。

（资料性）

南方水稻黑条矮缩病毒RT-PCR检测方法试剂除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器装。液氮：保存于液氮罐或保温桶中。RNAisoPLUS（购自宝生物工程（XX）有限公司）。氯仿。异丙醇：-20℃预冷。DEPC水：用1‰DEPC（焦碳酸乙二酯）处理后的去离子水。75％

乙醇（DEPC水配制）。X脂糖。Tris碱。冰乙酸。EDTA（0.5mol/L）。50×TAE配方:Tris碱242g，冰乙酸57.1mL，EDTA（0.5mol/L）100mL，定容至1000mL。PrimeScriptTMOneStepRT-PCRKit一步反转录试剂盒（购自宝生物工程（XX）有限公司）。DNAMarker（购自宝生物工程（XX）有限公司）。Gel-red染色工作液（购于Invitrogen公司）。仪器设备仪器设备包括：称量天平：精度等级为0.01g；高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）；冰箱（2℃～8℃和-20℃两种）；微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL）及配套吸头；Eppendorf管（1.5mL、2.0mL）；研砵。检测引物正向引物SRB-S10-F5’-CCACATCGCGTCATCTCAAACTAC-3’。反向引物SRB-S10-R5’-CGGTCTTACGCAACGATGAACC-3’。操作步骤采样工具下列采样工具应经（121±2）℃，高压灭菌15min并烘干。剪刀，镊子，研钵，Eppendorf管（1.5mL、2.0mL）。样品采集用剪刀剪取新鲜水稻叶片或茎秆组织，放入密闭的自封袋内，贴好标签，尽快运回实验室-20℃条件下保存待检，存放不能超过7d。样品保存新鲜样品若需长期保存应置于-70℃以下，避免反复冻融（冻融不超过3次）。总RNA提取步骤如下：取水稻组织0.1g，放入研钵中，倒入适量液氮，以研磨棒将样本磨碎至粉末状，转移至Eppend-orf管中；加入1mLRNAisoplus，充分混匀；每1mLRNAisoplus加入0.2mL氯仿，盖好管盖，大力震荡15s，室温静置5min；12000r/min，4℃离心15min；吸取c）各管中的上清液转移至Eppendorf管中，不应吸到中间层，向Eppendorf管中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，15℃～30℃静置10min；12000r/min，4℃离心10min，弃上清，加入600μL75％乙醇，上下颠倒洗涤；12000r/min，4℃离心5min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），弃上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）；4000r/min离心10s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到沉淀，室温干燥3min～5min；加入10μL～15μLDEPC水，轻轻混匀，冰上保存备用。若需长期保存应放置-70℃冰箱。RT-PCR检测扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的RT-PCR反应液，设所需RT-PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阳性对照、阴性对照、空白对照的数量和，每个样品测试反应体系配制见表A.1。每个样品测试反应体系试剂使用量终浓度PrimeScript1StepEnzymeMix2μL2×1StepBuffer（DyePlus）25μL正向引物SRB-S10-F1μL0.4μM反向引物SRB-S10-R1μL0.4μMTemplateRNA1μL～3μLRNaseFreedH2O补充反应体积至50μL循环条件设置将A.4.5.1中配制好反应液的PCR管放入PCR仪内，记录样本摆放顺序。循环条件设置：第一阶段：50℃反转录30min；第二阶段：94℃预热2min；第三阶段：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；第四阶段：72℃延伸5min。PCR反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存备用。电泳检测取PCR反应液5μL于预先混有Gel-