第二章基因工程的酶学演示文稿

第二章基因工程的酶学演示文稿本文档共114页；当前第1页；编辑于星期六\10点45分优选第二章基因工程的酶学本文档共114页；当前第2页；编辑于星期六\10点45分本文档共114页；当前第3页；编辑于星期六\10点45分本文档共114页；当前第4页；编辑于星期六\10点45分第二章基因工程的酶学基础Enzymes本文档共114页；当前第5页；编辑于星期六\10点45分本文档共114页；当前第6页；编辑于星期六\10点45分本文档共114页；当前第7页；编辑于星期六\10点45分(II类)限制性内切酶

限制性内切酶的存在给没给基因工程操作带来麻烦？限制性内切酶在基因工程操作中有哪些具体用途？本文档共114页；当前第8页；编辑于星期六\10点45分首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。(II类)限制性内切酶

分离的第一个酶是HindⅡ本文档共114页；当前第9页；编辑于星期六\10点45分一、限制性内切酶的基本特性

是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。（1）识别位点4—8bp，回文结构思考题1、在序列5’-CGAACATATGGAGT-3’中含有一个6bp的II类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么？2、下面几种序列中你认为哪一个（哪些）最有可能是II类限制性内切核酸酶的识别序列：GAATCG,AAATTT,GATATC,ACGGCA?为什么？本文档共114页；当前第10页；编辑于星期六\10点45分（2）内切酶与识别序列的结合模式1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG本文档共114页；当前第11页；编辑于星期六\10点45分（3）切割位点EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

产生？末端EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

产生？末端切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：识别位点处。本文档共114页；当前第12页；编辑于星期六\10点45分（4）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：①5’端凸出（如EcoRI切点）GAATTC

CTTAA

GG

AATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’本文档共114页；当前第13页；编辑于星期六\10点45分CTGCAG

②3’端凸出（如PstI切点）GACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG

G

ACGTC本文档共114页；当前第14页；编辑于星期六\10点45分

①连接便利（5）粘性末端的意义只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。本文档共114页；当前第15页；编辑于星期六\10点45分本文档共114页；当前第16页；编辑于星期六\10点45分凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端标记，3’末端加尾凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。本文档共114页；当前第17页；编辑于星期六\10点45分识别位点的序列相同的限制性内切酶。（6）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’本文档共114页；当前第18页；编辑于星期六\10点45分XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：本文档共114页；当前第19页；编辑于星期六\10点45分识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（7）同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。本文档共114页；当前第20页；编辑于星期六\10点45分5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A本文档共114页；当前第21页；编辑于星期六\10点45分二、DNA末端长度对限制酶切割的影响

限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。本文档共114页；当前第22页；编辑于星期六\10点45分

在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。另外，了解末端长度对切割的影响还可帮助在双酶切多克隆位点时选择酶切秩序。温馨提示——Becareful本文档共114页；当前第23页；编辑于星期六\10点45分表2-4：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸检测）限制酶

待测的寡核苷酸序列待测的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0表2-4：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸检测）限制酶

待测的寡核苷酸序列待测的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0限制酶待测的寡核苷酸序列待测的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0表1：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸检测）

本文档共114页；当前第24页；编辑于星期六\10点45分

某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。三、位点偏爱（Sitepreference）本文档共114页；当前第25页；编辑于星期六\10点45分

λ噬菌体DNA为48502bp，含12bp粘端。EcoRⅠ酶切割噬菌体中的5个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍；

某些噬菌体DNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性是不同的。如：本文档共114页；当前第26页；编辑于星期六\10点45分四、在实验室条件下进行酶切20微升反应体系本文档共114页；当前第27页；编辑于星期六\10点45分五、酶切反应条件终止酶切的方法缓冲液反应温度反应时间本文档共114页；当前第28页；编辑于星期六\10点45分缓冲液(Buffer)（1）缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。本文档共114页；当前第29页；编辑于星期六\10点45分不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI504525温度本文档共114页；当前第30页；编辑于星期六\10点45分

EcoRⅠ若反应16小时，所需酶量为正常酶切时间的1/8，即若反应时间为16小时，则所用酶量为只切1小时的1/8。

反应时间

反应时间通常为1小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。例如：本文档共114页；当前第31页；编辑于星期六\10点45分终止酶切的方法苯酚加热EDTA本文档共114页；当前第32页；编辑于星期六\10点45分

EDTA可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为10mM；

加热是常用的方法，对于最佳反应温度为37℃的酶，在65℃或80℃处理20分钟可使酶活性大部分丧失。

对于在80℃作用20分钟也有不失活的酶可用苯酚抽提去除蛋白，或用试剂盒纯化DNA。本文档共114页；当前第33页；编辑于星期六\10点45分与酶切反应条件相关的两个现象本文档共114页；当前第34页；编辑于星期六\10点45分

在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称。星号（*）活性。1、星号（*）活性本文档共114页；当前第35页；编辑于星期六\10点45分EcoRI和BamHI等都有*活性。在低盐、高pH（>8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的时候要特别注意！本文档共114页；当前第36页；编辑于星期六\10点45分内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。2、完全消化与局部消化123412341）、完全消化本文档共114页；当前第37页；编辑于星期六\10点45分只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。2）、局部消化123414本文档共114页；当前第38页；编辑于星期六\10点45分

请确定XbaI,XhoI和KpnI位点在DNA上的相对位置。本文档共114页；当前第39页；编辑于星期六\10点45分本文档共114页；当前第40页；编辑于星期六\10点45分六、影响限制性内切酶活性的因素外因内因

外因是可预见和控制的，如反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等等

内因包括位点偏爱性、甲基化底物、底物的构象。构象的影响主要指切割线性DNA和超螺旋DNA时的活性，如与切割DNA相比，EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ需要至少2.5-10倍的酶来切割pBR322的超螺旋DNA本文档共114页；当前第41页；编辑于星期六\10点45分从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。第二节DNA连接酶一、DNA连接酶（ligase)的发现DNA复制一定有断口。本文档共114页；当前第42页；编辑于星期六\10点45分（1）大肠杆菌连接酶1.两种DNA连接酶只能连接粘性末端。二、DNAligase的特点（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。本文档共114页；当前第43页；编辑于星期六\10点45分（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH，

5’端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+2.连接条件本文档共114页；当前第44页；编辑于星期六\10点45分1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、连接反应的机理2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3.AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi本文档共114页；当前第45页；编辑于星期六\10点45分4.AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP本文档共114页；当前第46页；编辑于星期六\10点45分5.3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。本文档共114页；当前第47页；编辑于星期六\10点45分连接酶反应的最佳温度是37C。四、连接反应的温度1.最佳温度但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。2.实用温度所以一般采用4~16C。本文档共114页；当前第48页；编辑于星期六\10点45分增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。1.插入片段与载体的浓度比例2.反应温度12.5℃。五、影响连接反应的因素10~20倍。一般14~16℃本文档共114页；当前第49页；编辑于星期六\10点45分第三节DNA聚合酶(自学)一、基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修饰过的T7DNA聚合酶6.逆转录酶本文档共114页；当前第50页；编辑于星期六\10点45分1.共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。2.主要区别T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。二、常用的DNA聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。本文档共114页；当前第51页；编辑于星期六\10点45分DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高3.常用DNA聚合酶的特性比较本文档共114页；当前第52页；编辑于星期六\10点45分三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大肠杆菌DNA聚合酶I主要用来制备带放射性标记的DNA探针。（1）大肠杆菌DNA聚合酶I的性质①一条单链多肽。②5’3’外切酶活性位于N端。③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成为Klenowfragment。本文档共114页；当前第53页；编辑于星期六\10点45分①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③带有3’—OH游离端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反应条件-OH5’3’dNTPs本文档共114页；当前第54页；编辑于星期六\10点45分标记①核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制备探针已知序列的核酸片断显示位置与互补的待测序列杂交本文档共114页；当前第55页；编辑于星期六\10点45分标记已知序列的核酸片断②探针的标记方式标记已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断5’3’本文档共114页；当前第56页；编辑于星期六\10点45分③DNA聚合酶I对探针序列的标记缺口转移法(nicktranslation)：放射性同位素标记：DNA聚合酶I同时具备5’3’外切酶活性和5’3’的聚合酶活性（以及3’5’外切酶活性）。本文档共114页；当前第57页；编辑于星期六\10点45分5’3’外切酶活性从DNA缺口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在缺口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。缺口缺口5’5’3’3’5’3’5’3’本文档共114页；当前第58页；编辑于星期六\10点45分纯化的DNA片断DNaseI制造单链缺口DNAPolI进行缺口转移一种-32P-dNTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记8本文档共114页；当前第59页；编辑于星期六\10点45分2.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性质DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草杆菌蛋白酶本文档共114页；当前第60页；编辑于星期六\10点45分①3’端补平5’5’klenow②DNA3’末端标记补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途本文档共114页；当前第61页；编辑于星期六\10点45分3’隐蔽末端的DNA片断Klenowfragment补平根据末端的顺序选择一种-32P-dNTPs末端标记的DNA限制性内切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h本文档共114页；当前第62页；编辑于星期六\10点45分③cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’5’5’3’引物本文档共114页；当前第63页；编辑于星期六\10点45分（1）T4DNA聚合酶的性质3.T4DNA聚合酶从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降解单链更快）。①来源②酶活性本文档共114页；当前第64页；编辑于星期六\10点45分③特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。本文档共114页；当前第65页；编辑于星期六\10点45分5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶无dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’本文档共114页；当前第66页；编辑于星期六\10点45分（2）T4DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法）用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。再利用它的5’3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。①补平隐蔽末端②DNA3’末端标记本文档共114页；当前第67页；编辑于星期六\10点45分酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’5’外切）DNA酶切片断T4DNA聚合酶（5’3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’内切酶切无dNTPs本文档共114页；当前第68页；编辑于星期六\10点45分a.放射性标记的优缺点：制作简单、高比放射性、放射自显影效果好。优点：缺点：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、对人体有害。要求在专门实验室操作。本文档共114页；当前第69页；编辑于星期六\10点45分b.非放射性标记i）生物素标记：生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素连接酶（biotinligase）催化与蛋白质共价结合。本文档共114页；当前第70页；编辑于星期六\10点45分纯化的DNA片断DNaseI制造单链缺口DNAPolI进行缺口转移生物素-dTTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中本文档共114页；当前第71页；编辑于星期六\10点45分光促生物素标记生物素连接臂光敏基因探针序列探针序列生物素连接臂光敏基因+光照本文档共114页；当前第72页；编辑于星期六\10点45分抗生物素蛋白（avidin）：链霉抗生物素蛋白（streptavidin）：生物素的识别——亲和素：是一种鸡卵清蛋白。细菌中avidin的类似物。能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：本文档共114页；当前第73页；编辑于星期六\10点45分ii）地高辛标记：可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒(kit)。地高辛的结合物是抗地高辛抗体。本文档共114页；当前第74页；编辑于星期六\10点45分本文档共114页；当前第75页；编辑于星期六\10点45分iii）偶联酶及其底物常用的两种酶：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。酶的作用：本文档共114页；当前第76页；编辑于星期六\10点45分化学发光底物本文档共114页；当前第77页；编辑于星期六\10点45分HRPO和AP的显色反应底物本文档共114页；当前第78页；编辑于星期六\10点45分发光反应机理本文档共114页；当前第79页；编辑于星期六\10点45分iv）用非放射性标记的探针检测原理生物素探针序列待测基因亲和素酶底物中间产物产物发光探针DNA用生物素或地高辛标记。亲和素或地高辛抗体与酶偶联。酶催化一个发光或显色反应。亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。本文档共114页；当前第80页；编辑于星期六\10点45分核酸探针杂交筛选法的缺点是：只检测是否有外源DNA插入，而不论该DNA是否表达出产物。本文档共114页；当前第81页；编辑于星期六\10点45分4.T7DNA聚合酶（1）来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：①T7基因5编码的大亚基：有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。②大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。本文档共114页；当前第82页；编辑于星期六\10点45分（2）T7DNA聚合酶的特点①持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。②3’5’外切酶活性高单链和双链都能降解。③不受DNA二级结构的影响其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍本文档共114页；当前第83页；编辑于星期六\10点45分②进行末端标记①以大分子量DNA为模板的合成如M13③补平隐蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法标记3’末端。与T4DNA聚合酶相同。合成补平3’隐蔽末端；水解修平3’突出末端。本文档共114页；当前第84页；编辑于星期六\10点45分5.修饰后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修饰后的T7DNA聚合酶的用途①DNA测序双脱氧法。②标记DNA3’隐蔽末端③更有效地补平末端本文档共114页；当前第85页；编辑于星期六\10点45分6.逆转录酶最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。（1）来源RNA肿瘤病毒。（2）AMV的性质由和两条多肽链组成。本文档共114页；当前第86页；编辑于星期六\10点45分①链有反转录活性和RNaseH活性。RNaseH：链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以5’3’或3’5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。RNaseHRNADNARNADNA本文档共114页；当前第87页；编辑于星期六\10点45分（3）逆转录酶的用途②链RNA-DNA杂交双链中5’3’DNA外切酶活性。①合成cDNA以oligodT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA本文档共114页；当前第88页；编辑于星期六\10点45分②合成DNA探针用随机引物（randomprimer）或oligodT做引物。随机引物：随机顺序形成的寡聚DNA片断。（理论上它能与各种序列的模板结合）③RT-PCR用的模板克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。本文档共114页；当前第89页；编辑于星期六\10点45分第四节DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶1.来源小牛胸腺。2.组成大小两个亚基。3.特性（1）5’3’DNA聚合酶活性（terminaltransferase）本文档共114页；当前第90页；编辑于星期六\10点45分②不需要模板！①需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。③底物可以是单链DNA、是3’—OH突出的双链DNA、

平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。④随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。DNA5’3’TTTdTTP，末端转移酶本文档共114页；当前第91页；编辑于星期六\10点45分4.末端转移酶的用途（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。外源DNA载体DNA5’3’5’3’CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端转移酶本文档共114页；当前第92页；编辑于星期六\10点45分（2）再生酶切位点便于回收克隆片断。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow补平本文档共114页；当前第93页；编辑于星期六\10点45分AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGAAGCTTTTTTCGAA末端转移酶dTTPAAAAAA外源DNA本文档共114页；当前第94页；编辑于星期六\10点45分（3）非放射性标记DNA片断的3’端AAGCTTTTTTCGAAGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位点HindⅢ位点连接催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。（生物素-11-dUTP等）本文档共114页；当前第95页；编辑于星期六\10点45分二、T4多核苷酸激酶1.来源T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2.功能催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。不论5’-OH端突出与否。本文档共114页；当前第96页；编辑于星期六\10点45分5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。本文档共114页；当前第97页；编辑于星期六\10点45分3.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP多核苷酸激酶3’P--OH5’3’HO--P5’碱性磷酸酶（1）正向反应（forwardreaction）本文档共114页；当前第98页；编辑于星期六\10点45分（2）交换反应标记法反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与DNA5’端的磷酸交换。3’P--OH5’3’HO--P5’3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反应效果不理想。本文档共114页；当前第99页；编辑于星期六\10点45分

三、碱性磷酸酶1.碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。具有抗热性。SDS中加热68oC可完全失活。本文档共114页；当前第100页；编辑于星期六\10点45分2.碱性磷酸酶的特性催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH碱性磷酸酶3.碱性磷酸酶的功能（1）防止线性化的载体份子自我连接本文档共114页；当前第101页；编辑于星期六\10点45分单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A碱性磷酸酶5’5’5’本文档共114页；当前第102页；编辑于星期六\10点45分A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能与脱磷酸的载体OH连接