仪器分析课件 色谱分析(气相)

Chromatography色谱分析法概述国产气相色谱仪HPLC液相色谱仪美国气相色谱仪一、概论俄国植物学家Tswett于1901年发现：利用吸附原理分离植物色素1903年发表文章：Onanewcategoryofadsorptionphenomenaandtheirapplicationtobiochemicalanalysis1906年Tswett

创立“Chromatography”—“色谱法”新名词1907年在德国生物会议上第一次向世界公开展示显现彩色环带的柱管（一）色谱分析法的历史石油醚俄国植物学家茨维特分离植物色素发明色谱经典装置色谱系统两相构成：

——其中的一相固定不动，称为固定相

——另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相色谱法定义色谱分离方式

当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动（竞争相互作用），混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。1930年库恩（Kuhn)利用色谱法分离研究维生素和胡萝卜素1935年AdamsandHolmes

发明了苯酚-甲醛型离子交换树脂，进一步发明了离子色谱1938年Izmailov发明薄层色谱1944年Consden,Gordon&Martin

发明纸色谱1952年Martin&Synge

发明气-液色谱1953年Janak发明气-固色谱1954年Ray发明热导检测器1957年Martin&Golay

发明毛细管色谱MilestonesinChromatography1959年Porath&Flodin

发明凝胶色谱1960年液相色谱技术完善(Waters)1954年我国研究成功第一台色谱仪（二）色谱方法的分类定义：色谱分离技术是借助色谱分离原理而使混合物中各组分分离的技术；将色谱分离技术应用于分析化学，称为色谱分析。色谱法的分类①按物理状态分类根据流动相的物态：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)根据固定相的物态：气-固色谱法、气-液色谱法、液-固色谱法、液-液色谱法②按操作的形式分类(1)柱色谱、(2)纸色谱、(3)薄层色谱③按分离机理分类(1)吸附色谱(2)分配色谱、(3)离子交换色谱(4)凝胶色谱其它色谱方法薄层色谱和纸色谱：

其它色谱方法超临界色谱高效毛细管电泳

九十年代快速发展、特别适合生物试样分析分离的高效分析仪器。（三）色谱法的特点

(1)高选择性、(2)高效能、(3)高灵敏度可以分析质量分数为10-6～10-9数量级、检出限量低至10-1lg的物质，适于微量和痕量分析（四）色谱法的应用

(1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析；(2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。(3)色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术，常用于制备分离，得到高纯样品。(4)色谱—质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。

气相色谱分析(GasChromatography,GC)（一）气相色谱法的特点①高效能(分离)填充柱都有几千块理论塔板(n)毛细管柱可达104块～105块理论塔板(n)，可以分析沸点十分相近的组分和极为复杂的多组分混合物②高选择性可分离同系物、同分异构化合物。③高灵敏度可以检测出10-11g～10-13g物质大气污染物分析：可以直接检出质量分数为10-9数量级的痕量毒物农药残留物的分析：可以检出农副产品、食品、水质中质量分数为10-6～10-9数量级的氯、硫、磷化合物④分析速度快一般分析可在几分到几十分钟内可以完成，某些快速分析1s内可以分析数个组分。气相色谱法分类

气相色谱：气体（称为载气）按分离柱内径：填充柱色谱

毛细管柱(<1mm)色谱按固定相：气-固色谱(吸附）

气-液色谱(分配）

（二）气相色谱法的基本概念1．色谱常用术语①色谱图各组分的浓度(或信号)随流出时间而分布的曲线称为色谱曲线，常称为色谱曲线图或色谱图。②基线没有试样进入检测器时，记录仪记录的是一条直线，这条直线称为基线。噪音：使基线发生细小的波动的现象。基线是在实验操作条件下，反映检测器系统噪声随时间变化的曲线。③色谱峰的高度、宽度、半峰宽度等参数★★峰高(h)：峰高h指色谱峰最高点到基线的距离，一般用cm为单位。

★★峰宽(Y)与半峰宽(Y1/2)从色谱峰两侧的转折点(拐点)(0.607h处）作切线，在基线上的截距叫峰底宽(Y)；简称峰宽；峰高一半（0.5h)处色谱峰的宽度叫半峰宽(Y1/2)

。由于色谱峰顶呈圆孤形，色谱峰的半峰宽并不等于峰底宽的一半。★★保留时间(tR):是指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需的时间=组分在流动相中停留的时间+

在固定相中所停留的时间★★调整保留时间(tR′)：组分的保留时间与死时间t0的差值：tR′=tR-t0它表示与固定相发生作用的组分比流动相在色谱柱中多滞留的时间，实际上是组分在固定相中所滞留的净时间。

★★相对保留值r2,1，α

组分2与组分1调整保留值之比：

相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。（三）气相色谱法的基本理论1.塔板理论假设：将一根色谱柱视为一个精馏塔色谱柱是由n个连续的、水平的塔板构成每一块塔板的高度为H组分气体以脉冲的方式进入塔板组分在每一块塔板上迅速达到分配平衡分配系数在各塔板上是常数气体的纵向扩散可以忽略不计气相色谱分离过程冲洗次数（n)

n次吸附-解吸附的分配平衡过程★★分配系数(K):当组分在流动相和固定相两相中达到分配平衡时，组分在两相中的浓度之比，称为分配系数(K)：K↑，在固定相中的溶解度或吸附能力↑，组分在固定相中的量↑，在流动相中的量↓。K↑进入固定相的组分↑，组分在固定相中滞留的时间越长，流出色谱柱所需的时间(tR)也就越长。组分在固定相中的质量浓度组分在流动相中的质量浓度★★分配比(k)定义：分配比是在一定温度、压力下，组分在两相间达到分配平衡时，两相间组分的质量比：分配比又称为容量因子或容量比分配比k的大小由下式计算：通过实验来测定分配比k的数值（所以比K应用多）k值越大，保留时间越长。k=0的组分，其保留时间即为死时间。式中β为相比。填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500①色谱峰的形状理论上：应得到正态分布的平滑曲线②混合组分的分离③结论色谱柱长：L，塔板高度：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：

n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：

单位柱长的塔板数越多，被测组分在柱内被分配的次数越多，表明柱效越高。

用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。

有效塔板数扣除了死时间的影响，较为真实地反映了柱效能的好坏。保留时间越长，Y或Y1/2越小，色谱峰越窄，理论塔板数越多，组分在两相间达到分配平衡的次数也越多，分离能力越强，柱效也就越高。

塔板理论无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。

柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。例4.2.2某色谱柱长2.1m，测得某组分的保留时间为5min42s，在色谱纸上量得色谱峰的宽度为1.2cm，已知纸速为2cm·min-1，求塔板高度。

解：将色谱峰的宽度换算成时间：塔板理论的优点：理论直观，能解释色谱分离过程，流出曲线的形状和浓度极大点(色谱峰)的位置，提出了柱效及根据流出曲线计算和评判柱效的依据，应用广泛。缺点：

理论建立在几点假设之上，不能解释塔板高度量受哪些因素的影响，也不能指出降低塔板高度的途径（选择和优化实验条件）。2.速率理论-影响柱效和塔板高度的因素范第姆特VanDeemter方程式：H=A+B/U+CU☆☆☆式中：U为流动相平均线速度，A为涡流扩散项，B/U为分子扩散项，CU为传质阻力项。减少A，B/U，CU三项的值，可以降低塔板高度量，减少色谱峰的扩张，提高柱效。固定相填充不规则因子固定相颗粒直径多径扩散项纵向扩散项组分在流动相中的扩散系数(1)与载气分子量(和粘度)成反比(2)与柱温成正比传质扩散项在吸附-解吸附移动过程（分配过程）中通过气相(流动相)和液相(固定液)及其界面所受的阻力固定液液膜厚度组分在固定液中的扩散系数组分在流动相中的扩散系数流速对柱效的影响H=A+B/U+CUA，B/U，CU越小，色谱柱的塔板高度H越小，柱效率越高。改善柱效率的因素：★选择颗粒较小的均匀填料★★选用较低的柱温操作★★★降低担体表面固定相液层的厚度★★★★选用合适的载气及载气流速：流速较小时，分子扩散项成为色谱峰扩张的主要因素，宜用相对分子质量较大的载气；流速较大时，传质项为控制因素，宜用相对分子质量较小的载气。范第姆特方程H=A+B/U+CU

速率理论的要点:被分离组分在色谱柱内运行的多路径（A)、浓度梯度(B)所造成的分子扩散及传质阻力(C)使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱分离和操作条件的选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各种因素相互制约(B和C)，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。

1．气固色谱固定相（吸附色谱）——活性炭：比表面积大，非极性性质，吸附性较强——氧化铝：弱极性。——硅胶：极性性质。——高分子多孔微球（GDX系列），新型的有机合成固定相（苯乙烯与二乙烯苯共聚）；极性范围广。——应用：种类有限，能分离的对象不多,气-固色谱不如气-液色谱应用广泛，主要用于永久气体和低沸点烃类的分析，在石油化工领域应用很普遍。(四）气相色谱固定相

2．气液色谱固定相（分配）气液色谱固定相=担体（支持体，载体）+固定(1).担体：化学惰性的多孔性固体颗粒，具有较大的比表面积。

——条件：比表面积大，孔径分布均匀；化学惰性，表面无吸附性或弱吸附，与被分离组份不起反应高的热稳定性和机械强度，不易破碎；颗粒大小均匀。一般常用60~80目、80~100目。

(1).担体（常用硅藻土（二氧化硅+无机盐））

A.红色担体：孔径较小，表孔密集，比表面积较大，机械强度好。适宜分离非极性或弱极性组分的试样。（受到其吸附活性中心的影响小。）缺点是表面存有活性吸附中心点。

B.白色担体：

煅烧前原料中加入了少量助溶剂(碳酸钠)。颗粒疏松，孔径较大。表面积较小，机械强度较差。但吸附性显著减小，适宜分离极性组分的试样。(2).固定液

高沸点难挥发(在操作温度下)有机化合物，种类繁多（上千种）。固定液的种类繁多，选择余地大，应用范围比气固色谱固定相大。

*对固定液的要求:应对被分离试样中的各组分具有不同的溶解能力，较好的热稳定性，并且不与被分离组分发生不可逆的化学反应。

——固定液分类

固定液与分离组分的相互作用（决定分离的主要因素）：静电力（极-极）、诱导力（极-非）、色散力（非-非）、氢键力固定液按化学结构分类：脂肪烃、醇、酯、聚酯、聚硅氧烷极性：弱强中强广谱固定液的相对极性：规定：角鲨烷（异三十烷）的相对极性为零，β，β’—氧二丙睛的相对极性为100常用4个固定液：SE-30，DC-710，PEG-20M，DEGS——固定液选择

基本原则

“相似相溶”，选择与试样性质相近的固定相

一般规律

分离非极性物质，选非极性固定液，按沸点次序，沸点低先出峰。

分离极性物质，选极性固定液，按极性次序，极性低先出峰。

分离极性、非极性混合物，选极性固定液，极性低先出峰。1.色谱分离中的四种典型情况（五）色谱分离的效果-分离度①分离效果差，柱效(n)低，选择性（

）低②完全分离，柱效(n)高，峰窄，选择性（

）低③完全分离，选择性（

）增加，柱效(n)低，峰宽④完全分离，柱效(n)高，选择性（）好2.分离度定义式R=1.0：分离程度98%

基本分离R=1.5：达99.7%完全分离假设Y2=Y1=Y（相邻两峰的峰底宽近似相等），k1≈k2=k，可导出下式：3.色谱分离基本方程式选择因子规律：

塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度(R)。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。

难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：

保留值（或分配系数、容量因子）之差──选择性因子

——色谱过程的热力学因素；

区域宽度──柱效——色谱过程的动力学因素。

提高n和是提高分离度的有效途径。

k的范围1<k<10，增加k对提高分离度有效。

（K>10，分析时间的延长会得不偿失）

①n↓，

↓,

R↓②n↑，

↓,

R↑

③n↓

，

↑,R↑

④n↑

，↑,

R↑

色谱峰越窄,柱效能越高；色谱柱的选择性越强，两组分的色谱峰相距越远；分离效果越好（分离度越高）。由上式可知：(1)增加塔板数可以提高分离度（固定相性质，柱长）(2)相对保留值γ2,1增大(两组分的tR’、K或k相差越大，固定相和流动相性质，柱温)，能显著地提高分离度两根同种色谱柱的相互关系式：例在一根1m长的色谱柱上测得两组分的分离度为0.68,要使它们完全分离(R=1.5),则柱长应为多少？从1m增加至5m，会给实际测定带来什么问题？……增加柱长对提高分离度有利，但组分的保留时间tR

↑

（分析时间长），且柱阻力↑，不便操作。—柱长的选用原则是在能满足分离目的的前提下，尽可能选用较短的柱，有利于缩短分析时间。—填充色谱柱的柱长通常为1~3m，内径3~4mm（GC中）。柱温(1)最高使用温度（超过该温度固定液易流失）

最低使用温度（低于此温度固定液以固体形式存在）(2)柱温升高，增加传质速度增加分子扩散

低沸点组份峰易产生重叠。(3)柱温降低，降低传质速度

增加分析时间峰拖尾(4)使最难分离组分尽可能分离的前提下，尽量用较低的柱温。组分复杂，沸程宽的试样，采用程序升温技术。程序升温（六）气相色谱仪1.气相色谱议的基本部件与作用气相色谱仪的流程：载气系统→进样系统→分离系统→检测系统→记录系统共五个主要组成部分气相色谱仪载气系统：包括气源、净化干燥管和载气流速控制目的：获得连续稳定（压力、流量）气流气体种类：N2,H2,

Ar,He进样系统：进样器及气化室；色谱柱：填充柱（填充固定相）或毛细管柱（内壁涂有固定液）；检测器：可连接各种检测器，以热导检测器或氢火焰检测器最为常见；温度控制系统：气化室、色谱柱和检测器的温度控制。气相色谱仪进样系统：进样器及气化室气相色谱分离系统SeparationsystemofGC毛细管柱Capillarycolumn毛细管：H=B/u+Cu,A,C,u,L怎样？ChromatogramofCompoundsfromFermentedCabbage(Capillarycolumn)2.气相色谱检测器气相色谱检测器可分为浓度型检测器与质量型检测器：浓度型检测器的响应值和组分的浓度成正比，质量型检测器的响应值和单位时间内进入检测器的质量成正比。常用的浓度型检测器有：热导池检测器(TCD)、电子捕获检测器(ECD)常用的质量型检测器有：氢火焰电离检测器(FID)、火焰光度检测器(FPD)热导检测器（ThermalConductivityDetector,TCD)（1）热导检测器的结构池体：一般用不锈钢制成。热敏元件：电阻率高、电阻温度系数大、且价廉易加工的钨丝制成。

参考臂：仅允许纯载气通过，通常连接在进样装置之前。测量臂：需要携带被分离组分的载气流过，则连接在紧靠近分离柱出口处。（2）检测原理:依据是组分和载气具有不同的热导系数.电阻丝～温度～散热速度～气体（载气、样品）导热系数

热敏元件

不同物质导热系数不同

RelativeThermalConductivityCompoundRelativeThermalConductivityCarbonTetrachloride0.05Benzene0.11Hexane0.12Argon0.12Methanol0.13Nitrogen0.17Helium1.00Hydrogen1.28（3）特点

—通用型检测器，

—浓度型检测器，

—不破坏样品，

—灵敏度较低，

—载气一般选H2，而不选N2

，H2导热系数与待测物差异大，灵敏度高。

氢火焰离子化检测器（Flameionizationdetector,FID)(1)氢焰检测器的结构

a.在发射极和收集极之间加有一定的直流电压（100-300V）构成一个外加电场。b.氢焰检测器需要用到三种气体：

N2：载气携带试样组分；

H2

：为燃气；空气：助燃气。

（2）检测原理：

—含碳有机物在氢火焰中燃烧时，产生化学电离，产生离子：

CnHm

---CH自由基

CH+O---CHO++eCHO++H2O---H3O++CO

—在电场作用下，正离子和电子被收集到两极，产生电流。（3）特点—质量型检测器—对有机化合物具有很高的灵敏度，比热导检测器的灵敏度高出近3个数量级—破坏样品—无机气体、水、四氯化碳等含氢少或不含氢的物质灵敏度低或不响应。—氢焰检测器结构简单、稳定性好、响应迅速。电子捕获检测器（Electroncapturedetector,ECD)

高选择性检测器，仅对含有卤素、磷、硫、氧等元素的化合物有很高的灵敏度，检测下限10-14g/mL，

对大多数烃类没有响应。

较多应用于农副产品、食品及环境中农药残留量的测定。具有定性功能的检测器（联用技术）

色谱-质谱；色谱-红外;色谱-原子吸收等。

质谱作为色谱的检测器使用需要解决四个问题：（1）色谱柱出口压力与质谱仪高真空之间的匹配；（2）试样组分与载气的分离；（3）质谱对色谱流出峰的快速测定（电子计算机解决）；（4）质谱仪的小型化（小型化的质量分析器）。（七）色谱定性、定量分析方法

一、色谱定性鉴定方法1.利用色谱图保留值定性（实验方法-外标、加标）

必须保证两者在各种操作条件的一致性！！2.利用文献保留值（消除了一些操作条件对保留值的影响，提高定性重现性。不需要标准品对照。）相对保留值r21（基准物对照）：—相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。—在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。保留指数I（一对正构烷烃对照)：—重现性较好的定性参数保留指数计算方法

将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100，如正己烷的保留指数为600

其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z＋1个碳原子（加入到被测样品中）。使得被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间：3.联用定性色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS）色谱-红外光谱仪联用仪；色谱-原子光谱联用仪。未知组分的定性、结构鉴定SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD（是目前解决复杂样品定性分析最有效工具之一）二、色谱定量分析方法1.峰面积的测量

（1）峰高（h）乘半峰宽（Y1/2）法：近似将色谱峰当作等腰三角形：

A=1.065h·Y1/2（2）峰高乘平均峰宽法：当峰形不对称时，可在峰高0.15和0.85处分别测定峰宽，由下式计算峰面积：

A=h·（Y

0.15+Y

0.85

）/2（3）自动积分和微机处理法2.定量校正因子

试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即：

mi=

fi·Ai

绝对校正因子：比例系数f

i

，单位面积对应的物质量：

f

i=mi/Ai相对校正因子f

'i

：即组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。

绝对校正因子fi的大小主要由物质的性质、操作条件和仪器的灵敏度所决定；当操作条件波动时，fi也发生变化。故fi无法直接应用，定量分析时，一般采用相对校正因子。3.常用的几种定量方法

特点及要求：

归一化法简便、准确；进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大；仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。（1）归一化法：

（2）外标法（ci

~mi

~Ai成线性)外标法也称为标准曲线法。特点及要求：

外标法不使用校正因子（抵消），准确性较高，操作条件变化对结果准确性影响较大,对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。试样配制：准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物mS计算式：若将内标法中的试样取样量w和内标物加入量ms固定，则：（3）内标法同一浓度+内标s进样1进样2Ai1>Ai2

isAi1

/

As1

=Ai2/

As2

Ci%

Ai/As不同浓度i

+内标s进样2进样1内标物要满