聚合酶链式反应扩增

聚合酶链式反应扩增第一页，共十七页，编辑于2023年，星期五

Aftertheexperimentdone,studentsshouldbeabletoexplaintheprincipleofPolymeraseChainReaction(PCR)andknowhowtorunaPCRexperiment.一、实验目的(ExperimentalPurpose)通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。第二页，共十七页，编辑于2023年，星期五二、实验原理(ExperimentalPrinciple)

PCRwasinventedbyKaryMullisandhiscolleaguesinthe1980s,itisarelativelysimpletechniquebywhichaDNAorcDNAtemplateisamplifiedmanythousandormillionfoldsquicklyandreliably.PCR技术是KaryMullis和他的同事于20世纪80年代发明的。该技术相对较为简单，它可以快速可靠地将DNA或cDNA模板扩增数千倍甚至上百万倍。第三页，共十七页，编辑于2023年，星期五Polymerasechainreaction(PCR)isusedtoamplifyasequenceofDNA,usingapairofoligonucleotideprimerseachcomplementarytooneendoftheDNAtargetsequence.TheseareextendedtowardseachotherbyathermostableDNApolymeraseinareactioncycleofthreesteps:denaturationoftemplate,annealingofprimersandextensionoftheprimers.聚合酶链式反应(PCR)用于利用一对寡核苷酸引物扩增一段DNA序列，其中每条引物分别与靶序列的两端互补。这对引物通过三步循环反应在热稳定的TaqDNA聚合酶的作用下各朝着对应的方向延伸，每步循环反应包括以下三个步骤：模板变性，引物退火和引物延伸。第四页，共十七页，编辑于2023年，星期五

Asfigureexplains,thistechniqueusesenzymeDNApolymerasetomakeacopyofadefinedregionofDNA.如图所示，它可以利用DNA聚合酶对一定区域内的DNA进行扩增。第五页，共十七页，编辑于2023年，星期五Firstahightemperature(about95℃)toseparatetheDNAstrands;（首先，高温(约95℃)使DNA双链解离）

Secondarelativelylowtemperature(about55℃)toallowtheprimerstoannealtothetemplateDNAstrands;（其次，在相对较低的温度(约55℃)下使引物与模板DNA链退火）

Thirdamediumtemper-ature(about72℃)toallowDNAsynthesis.

（然后，在适中的温度(约72℃)下使DNA合成。）

Eachcycletakesaslittleasafewminutes,anditusuallyrakesfewerthan30cyclestoproduceasmuchamplifiedDNAasweneed.第六页，共十七页，编辑于2023年，星期五AtypicalamplificationreactionincludesPrimers(引物)TemplateDNA(模板DNA)

TaqDNAPolymerase

(TaqDNA聚合酶)Nucleotides（寡核苷酸,dNTP）

PCRbuffer(PCR缓冲液)第七页，共十七页，编辑于2023年，星期五三、试剂与器材（Reagentsandapparatus）

Ⅰ.Instruments1.PCRAmplifier（PCR仪）2.ElectrophoresisSystem（电泳系统）3.Ultraviolettransilluminator（紫外透射仪）4.Bechtop（超净工作台）5.Autoclave（高压灭菌锅）

6.Pipettes（微量加样器）第八页，共十七页，编辑于2023年，星期五Ⅱ.Reagents1.Sterilewater无菌水2.10×PCRbuffer10×PCR缓冲液3.25mMMgCl2氯化镁

4.10mMdNTPs单核苷酸5.50μMoligonucleotideprimers1677F引物16.50μMoligonucleotideprimers2677R引物27.5unit/μlTaqDNApolymeraseTaqDNA聚合酶8.TemplateDNA模板DNA第九页，共十七页，编辑于2023年，星期五模板DNA:人淋巴细胞提取的DNA（指导合成亚甲基四氢叶酸还原酶基因片段）。

TaqDNA聚合酶:天为时代工程公司生产，含10×反应缓冲（100mMTris.HCl,PH=9.0,500mMKCl，不含MgCl2

），MgCl2溶液（25mM）以及Taq酶（500U），-20℃贮存。引物1677F:

5’TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA3’引物2677R:

5’AGGACGGTGCGGTGAGAGTG3’

以上引物由英骏生物技术有限公司合成。基因片段的上、下游引物合成产量为1OD，离心后开盖加入灭菌三蒸水配成终浓度为50μM的溶液，20μl分装后于-75℃贮存备用。第十页，共十七页，编辑于2023年，星期五四、实验步骤(ExperimentalProcedures)1.CombinethefollowingforeachreactioninaPCRtube(0.2ml）[在PCR(0.2ml）小管中将下列各组分混合]：第十一页，共十七页，编辑于2023年，星期五2.PrepareacontrolreactionwithnotemplateDNAandanaddition35.5µlofsterilewater.[设立对照反应，其中不含模板DNA，而加35.5µl无菌水。]3.Runthefollowingprogram:[按以下程序运行]95℃preheated8min

95℃1min.62℃1min.72℃1minfor36cycles.Programafinalextensionat72℃for7min.第十二页，共十七页，编辑于2023年，星期五PCRAmplifierStartFilesOptionsLidIncubate第十三页，共十七页，编辑于2023年，星期五1.制备1％琼脂糖凝胶。称取0.3g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入30mL的0.5×TBE缓冲液，放入微波炉加热至完全溶化，则为1％琼脂糖凝胶液。（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补足）2.制胶器的安装。3.将熔化的琼脂糖凝胶液转入Gelview专用的三角瓶中，然后加入Gelview

3µl。4.将冷到60℃左右，缓缓倒入制胶器(注意不要形成气泡)。5.待胶凝固后（30min），轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内。6.加入电泳缓冲液(0.5×)至电泳槽中。

4.Electrophoresegel.第十四页，共十七页，编辑于2023年，星期五(1)Loadsamplesormarkersmixedwithloadingbufferintowellswithapipettor.

用移液枪将样品或DNAMarker与上样缓冲液混合后点样至加样孔中。第十五页，共十七页，编辑于2023年，星期五(3)IlluminatethegelwithUVlightandthentakepictures.Bycomparingproductbandswithbandsfromtheknownmolecular-weightmarkers,youshouldbeabletoidentifyanyproductfragmentswhichareoftheappropriatemolecularweight.

(2)Electrophoreseonan1%agarosegel.Turnoffthepowersupplywhenbromophenol

bluedyefromtheloadingbufferhasmigratedadistancejudgedsufficientforseparationofDNAfragments.80