高分辨率溶解曲线

高分辨率溶解曲线第一页，共四十六页，编辑于2023年，星期六第二页，共四十六页，编辑于2023年，星期六内容提示高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用

—筛查突变（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）

—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—检测甲基化HRM仪器第三页，共四十六页，编辑于2023年，星期六第四页，共四十六页，编辑于2023年，星期六HighResolutionDNAMelting（HRM)是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的Tm值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：第五页，共四十六页，编辑于2023年，星期六PCRTube1Tube2Tube3WildtypeHomozygoteHeterozygoteLightScanner突变检测原理第六页，共四十六页，编辑于2023年，星期六Lightscanner高分辨溶解曲线结果第七页，共四十六页，编辑于2023年，星期六SaturatingdyeLCGreenplus——高分辨溶解曲线专用荧光染料第八页，共四十六页，编辑于2023年，星期六内容提示高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用

—筛查突变（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）

—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—检测甲基化HRM仪器第九页，共四十六页，编辑于2023年，星期六MutationScanning未知SNP扫描第十页，共四十六页，编辑于2023年，星期六M.H.Ye等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描，筛查其潜在SNPs。第十一页，共四十六页，编辑于2023年，星期六BernhardJ.HoWnger·Hai-ChunJing·KimE.Hammond-Kosack·KostyaKanyuka(BarleyApplication)TheorApplGenet(2009)119:851–865DOI10.1007/s00122-009-1094-2数据来自英国洛桑农业实验站Bernhard等对Barley的eukaryotictranslationinitiationfactor4E(eIF4E)gene基因外显子进行突变扫描结果第十二页，共四十六页，编辑于2023年，星期六第十三页，共四十六页，编辑于2023年，星期六内容提示高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用

—筛查突变（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）

—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—检测甲基化HRM仪器第十四页，共四十六页，编辑于2023年，星期六SmallAmpliconGenotyping扩增小片段直接进行基因型鉴定第十五页，共四十六页，编辑于2023年，星期六使用已知Tm值的双链DNA做温度内标，低温内标Tm(~61℃),高温内标Tm(~92℃)内标能够实现96/384孔板的温度均一矫正。PCR片段的Tm值范围：70-88℃优点：不需要探针，直接利用PCR产物针对已知突变位点进行基因分型第十六页，共四十六页，编辑于2023年，星期六第十七页，共四十六页，编辑于2023年，星期六第十八页，共四十六页，编辑于2023年，星期六第十九页，共四十六页，编辑于2023年，星期六为何要使用温度内标第二十页，共四十六页，编辑于2023年，星期六A>TSNPwithoutCalibration–72bp第二十一页，共四十六页，编辑于2023年，星期六ApplyTemperatureCalibration第二十二页，共四十六页，编辑于2023年，星期六A>TSNPwithCalibration第二十三页，共四十六页，编辑于2023年，星期六SmallAmpliconGenotypingM.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表纯合型CC和TT。第二十四页，共四十六页，编辑于2023年，星期六内容提示高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用

—筛查突变（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）

—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—检测甲基化HRM仪器第二十五页，共四十六页，编辑于2023年，星期六HRM–Lunaprobegenotyping第二十六页，共四十六页，编辑于2023年，星期六HRM–Lunaprobegenotyping第二十七页，共四十六页，编辑于2023年，星期六1Probe–1SNP,AllPossibleSNPs第二十八页，共四十六页，编辑于2023年，星期六1Probe–1SNP,AllPossibleSNPsClass1C:T,G:AClass2C:A,G:TClass3C:GClass4A:T第二十九页，共四十六页，编辑于2023年，星期六1Probe,2SNPs,1Amplicon第三十页，共四十六页，编辑于2023年，星期六2Probes,2SNPs,1Amplicon-ApoE第三十一页，共四十六页，编辑于2023年，星期六2Probes,2SNPs,2Amplicons-HFE第三十二页，共四十六页，编辑于2023年，星期六AmpliconScanning–发现新的突变第三十三页，共四十六页，编辑于2023年，星期六DavidDe，YongSongatel.Applicationoghigh-resolutionDNAmeltingforgenotypingandvariantscanningofdiploidandautotetraploidpotatoMolBreeding(2010)25:67–90rrRRRrMixRr:rrby1:1RrrrMixRR:Rrby1:1RRRr第三十四页，共四十六页，编辑于2023年，星期六内容提示高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用

—筛查突变（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）

—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—检测甲基化HRM仪器第三十五页，共四十六页，编辑于2023年，星期六RosarioMuleo（2009）等用HRM方法对三个品种的SSRDCA4进行分析，DCA4的等位基因有131bp的重复序列，杂合等位基因的序列为131-133bp，分析结果如图8所示，HRM曲线可以将纯合样品和杂合样品明显的区分，其中一个等位基因只相差2bp。

三种颜色（浅灰，深灰、黑色）表明3种不同的品种。

RosarioMuleo等得出结论：HRM是一种快速、重复性高、成本低，操作简单，且可以应用于其他物种的SNP检测及SSR基因分型的方法。RosarioMuleo,MarirChiaraColao,DarioMianoatel.2009Genome52:252-260第三十六页，共四十六页，编辑于2023年，星期六内容提示高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用

—筛查突变（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）

—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—检测甲基化HRM仪器第三十七页，共四十六页，编辑于2023年，星期六第三十八页，共四十六页，编辑于2023年，星期六第三十九页，共四十六页，编辑于2023年，星期六第四十页，共四十六页，编辑于2023年，星期六内容提示高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用

—筛查突变（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）

—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—检测甲基化HRM仪器第四十一页，共四十六页，编辑于2023年，星期六2005LightScanner96/38496/384孔板~8分钟/板~2-6秒/样品温度均一性：

0.15oC数据采集速度：大于100pts/秒升温速度：0.1oC/秒2010LS3232样品转盘,玻璃毛细管HRM检测60分钟内完成定量PCR和HRM检测HRM检测升温速度可以在0.05～0.90oC/秒之间调节在升温速度小于≤0.3℃/秒时，温度均一性：±0.05oC

数据采集速度：20pts/秒～400pts/秒（与升温速度有关）0.3oC/秒升温速度=67pts/℃0.05oC/秒升温速度=400pts/℃第四十二页，共四十六页，编辑于2023年，星期六LightScanner高分辨溶解曲线应用LunaProbes非标记探针基因分型未知SNP扫描SmallAmplicon小片段基因分型第四十三页，共四十六页，编辑于2023年，星期六HRM分析流程在PCR反应前加入LCGreen荧光染料时间大约2小时（包含试剂准备）在LightScanner上进行高分辨溶解曲线分析大约需要5-10分钟数据分析和处理大约需要5-10分钟

PCR产物可以直接进行下游的测序分析等（如需要）大约需要30-60分钟第四十四页，共四十六页，编辑于2023年，星期六LightScanner适于SNP分析速度、通量—L