-分子流行病学

动物病毒性疾病分子(fēnzǐ)流行病学研究方法

江西农业大学动物科技(kējì)学院何后军教授联系一页，共六十页。精选ppt分子(fēnzǐ)流行病学1972年Kilbourne博士在美国传染病学会(xuéhuì)第10次年会上作了题为“流感的分子流行病学〞的报告。1977年法国Higginson认为“分子流行病学〞是应用复杂精细的技术进行生物材料的流行病学研究。1982年Perera与Weinstein在分子流行病学根底上,提出了“癌症分子流行病学〞(molecularcancerepidemiology)第二页，共六十页。精选ppt一产生(chǎnshēng)的背景(一)疾病预防控制中的需求传染性疾病耐药性质粒；病原体变异；新发现传染病。慢性非传染病多病因、多阶段、多基因、长潜隐(qiányǐn)期。人群易感性生物个体间的遗传和环境不同，易感性差异很大；传统流行病学无法有效测量。实验医学实验医学的病因假设和防治措施的人群检验。第三页，共六十页。精选ppt一产生(chǎnshēng)的背景(二)分子生物学的快速开展理论的突破如：DNA双螺旋结构，遗传中心法那么，遗传密码子，RNA逆转录，断裂基因，操纵子模型，限制性内切酶，DNA聚合酶，DNA连结(liánjié)酶，染色体外遗传物质等。技术的创新凝胶电泳技术，核酸体外扩增，DNA测序，蛋白质测序，分子杂交，基因克隆，色谱技术，计算机应用。第四页，共六十页。精选ppt定义(dìngyì)分子流行病学(molecularepidemiology)是应用先进的技术测量生物标志的分布情况，结合流行病学现场研究方法，从分子或基因水平说明疾病的病因及其相关的致病过程，并研究疾病的防治和促进健康的策略和措施的科学。生物标志〔biologicalmarker，biomarker，简称M〕指能代表生物结构和功能(gōngnéng)的可识别物质。分子事件〔molecularevent〕或分子生物标志〔molecularbiomarker〕主要指代表生物结构和功能(gōngnéng)的生物大分子特征。如DNA、RNA、蛋白质等。第五页，共六十页。精选ppt现代流行病学遇到(yùdào)的难题〔1〕传染病方面：病原生物(shēngwù)的多样性和多变性，如流感病毒、艾滋病毒；抗生素广泛应用，耐药性病原体不断出现；新发现的传染病，SAS等传统表型研究从分子或基因水平说明〔2〕研究个体的发病差异根本说明个体差异必须从分子水平研究〔3〕证实疾病的病因第六页，共六十页。精选ppt(三)分子(fēnzǐ)流行病学的开展研究内容更加(gènjiā)丰富传染病、慢性非传染病、健康状态。研究手段越来越多主要是分子生物学方法和技术。应用范围不断扩大流行病学、预防医学、根底医学、生物学、遗传学、环境科学和人类学等。第七页，共六十页。精选ppt研究的水平不同：传统流行病学：宏观(hóngguān)水平或表型分子流行病学：微观水平或基因水平所解决的问题不同：传统流行病学：可说明暴露与发病之间的联系，但不能揭示疾病发生的机制〔黑匣子〕。分子流行病学：既可说明暴露与疾病之间的联系，又可揭示疾病发生的机制。即可以说明疾病的自然史。二、与传统(chuántǒng)流行病学的关系第八页，共六十页。精选ppt

暴露----------------------暴露(E)与剂量(ED)↓结局----------健康态(HC)←···机体···→临床态(CD)(健康疾病(jíbìng)连续带)

传统(chuántǒng)流行病学分子(fēnzǐ)流行病学

暴露生物标志-------------------外暴露标志(EEM)与剂量(EED)内暴露标志(IEM)与剂量(IED)生物作用标志(BAM)与剂量(BAD)

↓↓↓↓↓↓健康疾病连续带：健康态←→亚健康态←→潜在疾病态←→临界疾病态←→亚临床态←→临床态效应生物标志：

HCMEBEM

ASFMPMSCCMCDM

↑↑↑↑↑↑

易感生物标志-----------------------------易感标志与水平(SM&SL)

第九页，共六十页。精选ppt第十页，共六十页。精选ppt三、与分子生物学的关系(guānxì)

研究对象不同:分子生物学：个体分子流行病学：群体研究内容和方向(fāngxiàng)有所不同:分子生物学：根底研究〔方法学研究〕分子流行病学：应用研究〔指导疾病治〕第十一页，共六十页。精选ppt分子(fēnzǐ)流行病学的特点与传统流行病学的区别1.研究水平不同宏观水平微观水平2.所解决问题不同揭示(jiēshì)“黑匣子〞之谜与分子生物学的区别1.研究对象不同个体群体2.研究内容和方向有所不同侧重根底，侧重应用第十二页，共六十页。精选ppt分子(fēnzǐ)流行病学的主要研究内容传染病病因及流行规律的探讨非传染病病因及病因致病机制研究疾病易感性的测定疾病防治措施的研究疾病治疗效果和预后评价生物标志〔测量(cèliáng)指标〕的研究暴露测量及其与疾病的关系效应测量及其与疾病的关系易感性测量及其与疾病的关系疾病防治效果评价第十三页，共六十页。精选ppt传染病病因(bìngyīn)及流行规律的探讨对传染病，通过(tōngguò)分子流行病学研究可说明病原体特点，能更准确地分析其传染源和传播途径；对新发现的传染病，可以尽快确定传染病的病因和流行规律。第十四页，共六十页。精选ppt1、研究传染病的病原体和流行(liúxíng)特点基因水平研究病原体快速准确说明其特点分析病因、传染源和传播途径利于防治流行或爆发时病原体的鉴定和分型十分重要(zhòngyào)传统：从表型进行鉴定、分型不稳定或无法进行分型现在：从分子或基因水平鉴定、分型直接反映其遗传本质、特点稳定可靠第十五页，共六十页。精选ppt2、研究(yánjiū)新发传染病病原体和流行特点新发传染病分子流行病学研究方法查找病原体，确定(quèdìng)遗传特点说明病因、传播规律和流行特点如庚肝的发现和心肌V.别离第十六页，共六十页。精选ppt非传染病病因(bìngyīn)及病因(bìngyīn)致病机制研究病因复杂环境因素+遗传因素通过分子流行病学的研究方法可说明疾病发生(fāshēng)的遗传本质、环境因素致病的分子根底，为疾病的防治提供理论依据。第十七页，共六十页。精选ppt二、疾病(jíbìng)易感性的测定个体对疾病都存在一定的感受性，称之易感性以往认为：只有传染病才有确定易感性特异Ab传染性疾病的易感性与机体某些基因类型有联系，决定免疫反响的方式与强度慢性病也存在易感性，与个体基因型别或序列(xùliè)或其表达产物有关遗传易感性第十八页，共六十页。精选ppt三、疾病防治措施(cuòshī)的研究传染病的预防(yùfáng)通过分子流行病学手段，可以研究疫苗的预防效果、疫苗株引起的感染以及疫苗的逃逸株等问题。非传染病的防治分子流行病学通过研究病因的致病机制，为三级预防奠定理论根底。以肿瘤为例第十九页，共六十页。精选ppt四、疾病治疗效果(xiàoguǒ)和预后评价从分子或基因(jīyīn)水平评价治疗措施的效果及判断预后，更客观、快速、准确、节约对基因治疗，可能是唯一可行的评价方法。通过检测患者体内是否有导入的基因及导入的基因表达情况，判断治疗效果。第二十页，共六十页。精选ppt生物(shēngwù)标志与分子生物(shēngwù)学标志生物标志(biologicalmarkers，biomarkers)是宿主生物材料(组织、体液、细胞)中可测量的细胞的、生物化学的、免疫(miǎnyì)的或分子的改变。是可以测量的、能代表生物结构和功能的大分子物质，如DNA、RNA或蛋白质等。分子生物学标志(molecularbiomarkers)能反映分子水平、基因水平的DNA损伤、变异和表达的蛋白质分子的生物标志。第二十一页，共六十页。精选ppt生物(shēngwù)标志的分类在暴露-疾病链中，一般可将生物学标志分为:体内剂量标志、生物有效剂量标志、生物学反响标志、疾病标志，此外，尚有易感性标志：起着重要作用,是决定疾病能否发生的主要(zhǔyào)因素。常用按疾病发病过程进行分类，根据疾病发生的不同阶段出现不同的标志,分为三类：暴露标志、易感性标志和效应或疾病标志第二十二页，共六十页。精选ppt五、生物(shēngwù)标志暴露标志(exposuremarker)与疾病或健康状态有关的暴露因素的生物标志，包括外暴露标志和内暴露标志。效应标志指宿主暴露后产生(chǎnshēng)功能性或结构性变化的生物标志，如突变的基因、畸变的染色体等。易感标志指宿主对疾病发生、开展易感程度的生物标志。第二十三页，共六十页。精选ppt外暴露标志：是指暴露因素进入机体之前的标志和剂量生物性：微生物、寄生虫、生物毒素等;非生物性：某些(mǒuxiē)化学和物理因素，如吸烟烟雾、环境物质等。内暴露标志：指暴露因素进入机体之后的标志生物性病原因子：可以是生物病原因子本身、其代谢产物或与宿主体内生物大分子结合产物，像病毒整合基因、生物毒素-DNA加合物等非生物性病原因子：可以是体内转运分子、代谢产物或与宿主靶体结合物等，如暴露于苯并(a)芘后，在淋巴细胞中能检测到特异的DNA加合物。第二十四页，共六十页。精选ppt易感性标志(biāozhì)(susceptibilitymarker)易感性标志：指宿主对疾病发生、开展易感程度的生物标志，如宿主的遗传特征、营养、免疫、机体的活动状态等。是在暴露之前就已存在的遗传性或获得性的可测量(cèliáng)指标，决定着机体对疾病发生、开展的易感程度。可以探讨疾病发生的个体差异。第二十五页，共六十页。精选ppt效应标志(biāozhì)(effectmarker)或

疾病标志(biāozhì)(diseasemarker)宿主暴露于某种因素(yīnsù)后产生结构或功能性变化的生物性标志，如突变的基因、畸变的染色体、特异抗体、细胞因子等。在病后的不同阶段，其效应标志不同第二十六页，共六十页。精选ppt生物(shēngwù)标志的筛选要求：具有(jùyǒu)较好的特异性和稳定性检测方法具有较高的灵敏度，特异度高检测方法快速、简便依据：研究目的、生物学标志的本身特性、在疾病过程中的意义、检测方法、生物学标志与所要代表的特定阶段的关联程度。第二十七页，共六十页。精选ppt生物标志(biāozhì)特性分子特性化学结构、组成、物理特性和稳定性等时相特性即生物学标志存在的时间长短及其在暴露(bàolù)至疾病不同阶段的表现和意义。变异性-个体内变异生物标本采集时间、部位等不同造成-个体间变异不同生物个体的检测结果不相同-群体间变异不同生物群体的检测结果不相同-储存变异生物标志的生物特性、储存条件、储存时间等都会影响其检测结果第二十八页，共六十页。精选ppt生物标志(biāozhì)检测方法实用性

研究样本一般较大一定(yīdìng)的实验室条件可信性可信性强有效性灵敏度和特异度，注意区分流行病学的灵敏度和实验室测量中所谓的敏感性的不同第二十九页，共六十页。精选ppt暴露(bàolù)测量外暴露研究

指环境因素暴露，分为(fēnwéi)生物性因素和非生物性因素。作为分子流行病学测量的生物标志一般是生物性病原因子，如病原生物、生物毒素等。第三十页，共六十页。精选ppt生物性病原因子检测鉴定流感嗜血杆菌病原生物进化变异(biànyì)规律研究O157大肠杆菌确定传播途径S.munchen菌感染非生物性因素的暴露测量吸烟烟雾可研究病原生物分型、分类和检定是最有效手段、研究病原生物变异的规律等。这是传染病分子流行病学的重要使命。第三十一页，共六十页。精选ppt内暴露(bàolù)研究传染性疾病

应用分子生物学方法直接检测病原体的生物大分子物质如核酸(hésuān)、蛋白质等，使我们能够准确地判断人体是否感染疾病，即感染状况；用分子生物学技术鉴定各感染者所感染病原体之间的遗传关系，可追踪传染源

慢性非传染性疾病内暴露水平生物作用水平第三十二页，共六十页。精选ppt效应(xiàoyìng)测量传染病

免疫效应：测定体内抗体变化可以判断机体感染状态。

病理性效应：测量机体损害性的生物标志可以判断病原生物感染的病理效应。

慢性非传染病

基因表达异常和代谢异常基因突变或染色体畸变

健康状态：一个群体从疾病到健康或从健康到疾病也是一个连续带。通过健康状态相关生物标志分布的研究，如生长、发育和衰老，可以为探讨影响(yǐngxiǎng)健康的因素、制订促进健康的策略和措施提供科学依据。

第三十三页，共六十页。精选ppt易感性测量(cèliáng)探明遗传病易感(致病)基因、分布规律、影响因素和防制手段，传染病和寄生虫病的易感性水平上下可以从两个(liǎnɡɡè)方面评判，一是特异抗体水平，二是对该病原体致病的遗传易感性。第二方面那么是分子流行病学研究的重要内容之一。。第三十四页，共六十页。精选ppt疾病防治效果(xiàoguǒ)评价预防评价：分子生物学技术可用于传染病的预防效果评价中，如疫苗接种后的免疫学效果、也可以对不同人群采取措施与否的感染情况(qíngkuàng)进行分析。另外也可用于预防接种发病研究。

治疗评价：应用分子流行病学进行治疗措施的效果评价比以临床诊断为依据的效果评价要节约时间、费用和人力，而且更加客观。第三十五页，共六十页。精选ppt应用生物学标志(biāozhì)的意义能精确测量暴露因素及其水平；揭示生物学反响的早期事件(shìjiàn);判定宿主的易感性;提高筛检和诊断疾病的准确性和精确性;评价治疗措施或干预措施的效果;估计疾病的预后;有效控制病因推断过程中的混杂因素;揭示疾病的发病机理。第三十六页，共六十页。精选ppt分子(fēnzǐ)流行病学应用的主要研究方法测量(cèliáng)指标标本采集现场调查研究方法实验室检测技术研究设计资料分析

第三十七页，共六十页。精选ppt测量(cèliáng)指标的选择的原那么生物标志应特异、稳定标本采集、储存方便检测方法比较简单、实用，而且操作标准(guīfàn)，便于与同类研究结果比较检测方法灵敏度和特异度高第三十八页，共六十页。精选ppt测量(cèliáng)指标暴露指标最好能代表接触剂量或生物作用剂量易感性指标

一般选择抗体水平作为传染病易感性指标，易感基因及其表达产物等作为心脑血管病、恶性肿瘤、糖尿病、遗传病等慢性非传染病的易感性标志。效应指标

一般以最早期生物效应标志作为探索暴露因素的致病作用或干预措施的短期效果评价指标，如抗体产生、代谢异常、基因表达异常等选择结构和功能改变作为确定(quèdìng)暴露的致病作用和早期诊断、早期预防的指标临床诊断标志作为干预措施长期效果评价或预后的指标第三十九页，共六十页。精选ppt标本(biāoběn)采集生物标本一般包括病原的和人体的生物标本。常用的有：微生物标本、血液〔血清〕标本、组织标本、其他生物标本〔如唾液、胃液(wèiyè)、尿液、精液、头发、媒介生物等〕生物标本库通常将储存有一种类型或多种类型生物标本，并能保持它们的生物活性以供研究之用的系统称为生物标本库(biologicalspecimenbank,BSB)，如血清库、组织库、病原生物库等。第四十页，共六十页。精选ppt生物标本采集(cǎijí)和储存分子流行病学研究成功的关键要求在采集和储存过程中不能受到“污染〞储存的生物标本在任何时候进行检测都可以获得一致的结果所有的生物标本都应有详细的背景材料和鉴别标识第四十一页，共六十页。精选ppt现场调查(diàochá)研究方法传统的现场流行病学研究方法,即描述性研究、分析性研究与干预性研究均可应用于分子流行病学。一般需要(xūyào)的样本量相对较小不宜作大规模现场调查研究分子流行病学在横断面研究中多是小样本抽样调查，在分析性研究中多为病例对照研究、队列与病例对照结合的巢式病例对照研究、病例-病例研究等，在实验性研究也多采用小样本随机对照试验。第四十二页，共六十页。精选ppt实验室技术(jìshù)标本的采集与储存：生物标本：病原的、动物(dòngwù)的生物标本。生物标本库〔biologicalspecimenbank,BSB〕：是指储存有一种类型或多种类型生物标本，并能保持它们的生物活性以供研究之用的系统。常用的生物标本：微生物标本、血液标本、组织标本、其他生物标本〔如唾液、胃液、尿液、精液、头发、媒介生物〕生物标本储存:冷藏〔0℃短期储存,-80℃长期储存〕第四十三页，共六十页。精选ppt生物标本(biāoběn)采集和储存是研究成功的关键要求：〔1〕在采集和储存过程中不能受到“污染〞，包括外界生物的、化学的和其他标本的“交叉(jiāochā)污染〞。〔2〕储存的生物标本在任何时候进行检测都可以获得一致的结果。〔3〕所有的生物标本都应有详细的背景材料和鉴别标识。第四十四页，共六十页。精选ppt实验室常用检测(jiǎncè)技术核酸技术

核酸电泳图谱核酸酶切电泳图谱核酸分子杂交核酸体外扩增核酸序列(xùliè)分析PCR蛋白质技术凝胶电泳、蛋白转印杂交、色谱分析、蛋白质测序酶学技术多位点酶电泳法生物芯片技术基因芯片其他技术

免疫学技术如酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光免疫试验(FIA)等；色谱技术如高效液相色谱技术(HPLC)等第四十五页，共六十页。精选ppt研究(yánjiū)设计要点：研究假设的建立：力求明确，并有相应的分子生物学技术可予以检验。研究模式的选择：〔见调查(diàochá)研究方法〕生物标志的选择：既要考虑到标志物的特异性、检测的敏感性、稳定性以及费用等，更要考虑研究的假设或目的。以上构成了分子流行病学研究设计中的三个相互联系的根本要素，而研究假设首当其冲。第四十六页，共六十页。精选ppt遗传因素的考虑应与遗传流行病学研究设计一并考虑。宏观资料的收集：不应无视偏倚的控制：选择偏倚：样本选择偏倚、标本采集偏倚〔如采集的部位、时间、机体状态、方法等〕信息偏倚：检测偏倚、标本储存偏倚〔储存条件和时间〕。混杂偏倚：也可出现。辅以动物实验研究问题(wèntí)动物实验可以较好控制影响因素，连续采样、动态观察研究样本量的估计问题原理和方法同一般流行病学研究设计。第四十七页，共六十页。精选ppt资料(zīliào)分析传统流行病学分析生物标志发生率、检出率、危险度；均数、标准差等血清流行病学分析抗体(kàngtǐ)的几何平均滴度、阳性率、感染率等遗传多态性分析等位基因频率、遗传多态度、杂合度等遗传关系分析过遗传一致性(如相似系数S)、遗传差异(如遗传距离D)遗传关系树等第四十八页，共六十页。精选ppt研究(yánjiū)设计研究目的充分考虑创新性、实用性、可行性测量指标生物标志是否特异、稳定，标本(biāoběn)采集是否方便，是否有灵敏而特异的检测方法测量方法简便、成熟，灵敏度和特异度高调查方法与样本样本有代表性，适量结果与分析设计中要预测研究结果，并根据选择的测量指标和测量方法确定资料分析方法质量控制注重现场质量控制的同时，特别重视实验室的质量控制本卷须知预实验第四十九页，共六十页。精选ppt基因型(genotype)：具有相同遗传结构的一类生物体。克隆(clone)：广义许多生物特征〔表型或基因型〕相同的生物体，虽然别离来源、地区、时间可能不同，但它们的这些特征几乎只能解释为共同来源，那么这些生物体称为一个克隆。狭义一个生物体的无性繁殖群体，称为一个克隆。克隆群(clonecluster)：遗传关系非常(fēicháng)紧密的多个生物克隆，可以划分为一个克隆群。第五十页，共六十页。精选ppt第五十一页，共六十页。精选ppt实例(shílì)一研究题目人汉坦病毒病〔SNV〕与病毒宿主关系确实定测量标志〔SNV〕/鹿鼠组织、血清、肺；死者取肺组织、存活者采集外周血单核细胞〔介质〕测量方法PCR、Westernblotting研究设计SNV病毒的序列患者住宅的鹿鼠、附近对照住宅的鹿鼠、远处(yuǎnchǔ)对照住宅的鹿鼠，所携带SNV病毒的序列比对；用蛋白印迹法进行SNV的IgM和IgG抗体检测患者和死亡者的感染情况；用反转录PCR(RT－PCR)扩增SNVRNA中的特征片段,比较该片段上患者体内病毒与鼠携带病毒的基因序列，应用种系发生分析法判定病毒与宿主的联系。结果分析从基因水平证明了该病毒是由鹿鼠传染给人的；证明暴露地点为家庭居住地结论：本研究将先进的分子生物学技术和流行病学现场调查有机地结合起来。采用分子流行病学方法,有力地证实了SNV病毒是经鹿鼠传播给人的,并明确了暴露地点,有助于深入研究相关因素,以有效地控制汉坦病毒肺综合征的发生与流行。第五十二页，共六十页。精选ppt实例(shílì)二

研究目的研究布鲁氏菌的生物标志测量指标布鲁氏菌的核苷酸序列同源性测量方法基因外重复回文PCR(REP－PCR)、细菌内基因重复一致PCR(ERIC－PCR)和核酸测序研究设计研究者选择了来自近20个国家和地区的34株不同种、不同生物型的布氏杆菌，这些细菌分属于牛种、猪种、犬种、沙林鼠种、羊种、绵羊附睾种等6种7个生物型。进行分子水平的进一步分型研究。结果分析用REP－PCR技术可把34种布氏杆菌进一步分为9个型，后以ERIC－PCR又可分出13个型，综合这两种方法