利用框内缺失法构建变异链球菌srtA基因缺失株

利用框内缺失法构建变异链球菌srtA基因缺失株陈璇浏海霞;彭显;邹玲【摘要】ObjectiveToconstructsrtA-genedeletionmutantofStreptococcusmutans(S.mutans)UA159withIFDC2cassettethroughoverlappingpolymerasechainreaction(PCR)andallelichomologousrecombination.MethodsFirst,theupstreamanddownstreamfragmentssurroundingthesrtAandIFDC2cassettewerePCRamplifiedandligatedthroughover-lappingPCR.TheresultingampliconwastransformedintoUA159,andpositivetransformantswereselectedonBHIplatescontainingerythromycin.Second,upstreamanddownstreamfragmentsofsrtAwithoverlapregionsweregeneratedbyPCRandwereoverlappedtocreateupA-downamplicon.Then,theupA-downampliconwastransformedintotheaforementionedpositivetransformantsandselectedonBHIplatescontainingp-Cl-Phe.ResultsThePCRanalysisandDNAsequencingresultsindicatedthatthecodingregionofthesrtAwascompletelydeleted,andtheupstreamanddownstreamregionsflankingthesrtAwereligatedseamlessly.ConclusionThemarkerlesssrtA-deletionmutantofS.mutanswasconstructedsuccessfully,whichlaidafoundationforfurtherstudyofitsbiologicalfunctionandinfluenceonthebiofilmformationofS.mutans.%目的利用框内缺失法，通过IFDC2基因盒及融合聚合酶链反应(PCR)、同源重组技术构建变异链球菌UA159菌株srtA基因缺失株.方法PCR扩增变异链球菌UA159菌株srtA基因上下游同源片段及IFDC2基因盒，将这些片段连接、转化入UA159,替换srtA基因同源片段，筛选、鉴定红霉素抗性克隆;PCR扩增、连接UA159srtA基因上下游同源片段，将连接片段转化入前述红霉素抗性克隆中替换IFDC2同源片段，筛选、鉴定抗苯丙氨酸类似物p-chloro-phenylalanine(p-Cl-Phe)克隆.结果PCR、琼脂糖凝胶电泳及DNA测序结果均证明srtA基因编码区被完全删除，上下游片段无缝连接，成功构建UA159srtA基因缺失株.结论本研究成功构建了无标记的变异链球菌UA159srtA基因缺失株，为进一步研究该基因在生物膜中的作用及其调控机制奠定了基础.【期刊名称】《华西口腔医学杂志》【年(卷)，期】2017(035)006【总页数】5页(P588-592)【关键词】变异链球菌;srtA基因缺失;框内缺失法【作者】陈璇浏海霞;彭显;邹玲【作者单位】口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科，成都610041;口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科，成都610041;口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科，成都610041;口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科，成都610041【正文语种】中文【中图分类】Q781龋病是发生在牙齿硬组织的慢性感染性疾病［1］。变异链球菌是公认的主要致龋菌之一［1-3］，其致龋毒力主要包括：促进细菌在牙齿表面的聚集和黏附、较强的产酸和耐酸能力等［3］。细菌黏附至牙齿表面并形成生物膜是龋病发生的必要条件［1,3］。变异链球菌表面蛋白P1、GpbC及WapA等都与其黏附能力紧密相关［1,4］，而这些蛋白都是由变异链球菌srtA基因编码的分选酶sortaseA（SrtA）识别并共价锚定到菌细胞壁上发挥作用的［3,5］。变异链球菌srtA基因缺陷可导致其表面蛋白P1等的分布和功能障碍，从而抑制变异链球菌在牙面的黏附增殖和生物膜的形成，其致病能力也相应减弱［1-2,6-7］。因此，SrtA是影响变异链球菌黏附能力的重要毒力因子。以往研究中使用的srtA基因缺陷株多是采用插入突变和带标记的等位同源突变两种方法构建的，这两种技术中夕卜源DNA片段的引入、明显的极性效应都可能影响研究结果的可信度［8-10］。框内缺失法是目前常用的构建无标记基因缺失株的方法之一［9-10］,利用IFDC2基因盒及等位同源交换技术可以高效快捷地完成框内缺失突变株的构建。IFDC2基因盒最初由Xie等［10］设计，由启动子ldh、突变的pheS基因片段（mpheS）及ermAM基因片段三部分构成。本基因盒中的ermAM基因片段使转化子带有红霉素抗性从而实现阳性筛选［10］。pheS基因编码苯丙氨酸-tRNA合成酶a亚基，在其发生突变并整合入受体菌基因组后，可使转化子对苯丙氨酸类似物p-chloro-phenylalanine（p-Cl-Phe）产生获得性敏感［11］,利用此原理可以实现转化子的阴性筛选从而获得无标记的基因缺失株。本研究拟利用框内缺失法，通过IFDC2基因盒及相关技术构建无标记的变异链球菌srtA基因缺失株，为进一步研究srtA基因的功能性状及其对变异链球菌致龋毒力的影响提供实验菌株。1.1菌株及培养条件、试剂及仪器变异链球菌UA159菌株、IFDC2基因盒由Dr.JustinMerrit（俄克拉荷马大学健康科学中心口腔生物学专业，美国）惠赠。菌株的培养条件为37°C、5%CO2兼性厌氧培养。细菌基因组DNA提取试剂盒［DP302型，天根生化科技（北京）有限公司］、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（2500-01型，Omega公司，美国），KODPlusDNA高保真聚合酶试剂盒（KOD-201型，Toyobo公司，日本），琼脂糖（Invitrogen公司，美国），细菌感受态刺激肽（competencestimulatingpeptide，CSP）（由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供），红霉素（分装，Amreso公司，美国），p-Cl-Phe（Sigma公司，美国），脑心浸液肉汤（brainandheartinfusion，BHI）培养基（Oxoid公司，英国），琼脂（北京博奥拓达科技有限公司）。细菌培养箱（AnaeroboxIV型，GeneScience公司，美国），超净工作台（1300SeriesA2型，ThermoFisherScientific公司，美国），聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）仪（S1000Thermocycler型）、琼脂糖凝胶电泳仪（Sub-CellGTCell型）（Bio-rad公司，美国），分光光度计（Spectronic200型，Thermo公司，美国）。本研究所用引物合成、DNA测序均由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成。1.2细菌培养及细菌基因组DNA（genomeDNA,gDNA）提取将-80°C保存的UA159菌株复苏于BHI培养基，形态学和生化鉴定后将平板保存于4°C作短期保种，并于平板上挑取单克隆接种于BHI液体培养基中，取过夜培养菌液按细菌基因组DNA提取试剂盒说明提取细菌gDNA，测定纯度及浓度后-20°C保存。1.3目的片段PCR扩增及连接以提取所得细菌gDNA及IFDC2基因盒为模板，利用KOD-PlusDNA聚合酶试剂盒PCR扩增UA159srtA基因上游同源片段（记为叩，大小约1kb）、下游同源片段（记为down，大小约1kb）、IFDC2片段（记为IFDC2，大小约2kb）;引物根据srtA基因（GenBankaccessionnoNC_004350.2）与IFDC2序列［10］分别设计：叩F/叩R-IFDC2、IdhF/ermR与dnFIFDC2/dnR（引物序列见表1）,其中引物ldhF和ermR为IFDC2片段的上下游引物；为进行后续融合PCR，引物叩R-IFDC2设计为srtA基因上游同源片段的特异性引物叩R+ldhF部分反向互补片段，引物dnFIFDC2设计为ermR部分反向互补片段+srtA基因下游同源片段的特异性引物dnF。采用PCR分别扩增，获得片段up、IFDC2与down。反应条件为94°C预变性2min;94^变性15s,55^退火30s,68°C分别延伸1min、2min15s、1min,35个循环，68°C再延伸4min。4°C结束反应后，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，胶回收并测定产物浓度和纯度，-20C保存。以up、IFDC2、down三片段为模板，upF和dnR为引物，融合PCR连接上述三片段（记为叩-IFDC2-dn，大小约4.1kb）。反应条件为94°C预变性2min;94^变性15s,55^退火30s,68^延伸4min15s,35个循环；68°C再延伸4min。4°C结束反应后，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，-20C保存。1.4第一步转化及筛选从1.2中平板上挑取UA159单克隆接种于BHI液体培养基中，取过夜培养菌液按1:20稀释于BHI培养基后培养2~3h，直到菌液OD600=0.2~0.3。取菌液按如下分组进行加样，a组：500|1L菌液+5|1L叩-IFDC2-dn+0.5|1LCSP（1pg-pL-1）[12];b组：500pL菌液+0.5pLCSP（1pg・pL-1）;c组（阴性对照）：500pL菌液。加样混合后培养2h,取a、b、c三组菌液各200pL分别于含有12.5pg-mL-1红霉素的BHI琼脂平板涂板培养48h。随机挑取a组平板上部分阳性单克隆接种于含12.5pg-mL-1红霉素的BHI液体培养基中，以过夜培养菌液及UA159菌液（对照）为模板，加入引物checkF/checkR（引物序列见表1）,PCR扩增后1%琼脂糖凝胶电泳检验第一步转化结果，将阳性克隆-80C保种。1.5第二步转化的目的片段PCR扩增及连接以UA159细菌gDNA为模板，利用KOD-PlusDNA聚合酶试剂盒PCR扩增UA159srtA基因上游同源片段（记为叩△,大小约1kb）及下游同源片段（记为down,大小约1kb）;弓物为upF/叩dnR和dnF/dnR（弓物序列见表1）,为进行后续融合PCR，引物叩dnR设计为srtA基因上游同源片段的特异性引物upR+dnF部分反向互补片段。采用PCR分别扩增，获得片段叩△与down，反应条件94°C预变性2min;94^变性15s,55^退火30s,68^延伸1min,35个循环；68C再延伸4min。4C结束反应后，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，胶回收并测定产物浓度和纯度，-20C保存。以叩&down两片段为模板，upF和dnR为引物，融合PCR连接上述两片段（记为叩Jdn，大小约2kb）。反应条件94C预变性2min;941变性15s,551退火30s,681延伸2min15s,35个循环；68C再延伸4min,4。&吉束反应后，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，-20C保存。1.6第二步转化及筛选将第一步转化成功的阳性克隆接种至含12.5pg-mL-1红霉素的BHI液体培养基过夜培养后，于含12.5pg-mL-1红霉素的BHI琼脂平板上划线培养48h，挑取单克隆接种于含12.5pg-mL-1红霉素的BHI液体培养基，取过夜培养菌液按1:20稀释于不含红霉素的BHI液体培养基培养2~3h，直至菌液OD600=0.2~0.3。取菌液按如下分组进行加样，a组：500皿菌液+5皿upA-dn+0.5皿CSP（1pg-pL-1）;b组：500|1L菌液+0.5|1LCSP（1pg-pL-1）;c组（阴性对照）：500皿菌液；加样混合后培养2h,取a、b、c三组菌液各200皿分别于含有4mg-mL-1p-Cl-Phe的BHI琼脂平板涂板培养48h。随机挑取a组平板上10个单克隆接种于BHI液体培养基中，以过夜培养菌液及第一步的阳性克隆菌液（对照）为模板，加入引物checkF/checkR（引物序列见表1）,PCR扩增后1%琼脂糖凝胶电泳检验第二步转化结果，并将琼脂糖凝胶电泳观察到的阳性克隆送DNA测序，将正确测序结果对应的阳性克隆-80°C保种。2.1红霉素抗性转化子的鉴定将1.4中a、b、c三组平板培养48h后，仅a组有菌落生长，b、c组均无菌落长出，表明a组菌落获得红霉素抗性。随机挑取a组部分单克隆培养后用引物checkF/checkR进行PCR,1%琼脂糖凝胶电泳后的结果见图1:以变异链球菌UA159为模板扩增出包含srtA基因的片段长度约为2.6kb（对照），包含IFDC2的同源片段大小应为4.1kb，结果均与预期一致，未见非特异性扩增及拖尾现象，说明挑取的所有阳性克隆中srtA基因均被等位同源交换为IFDC2基因盒。2.2无标记srtA基因缺失株的鉴定将1.6中a、b、c三组平板培养48h后，均有菌落长出，a组平板菌落数与b、c组相比无肉眼可见差异。随机挑取a组平板10个单克隆培养以后用引物checkF/checkR进行PCR,1%琼脂糖凝胶电泳后的结果见图2:包含IFDC2基因盒的检测片段长度应为4.1kb，敲除srtA基因后其上下游无缝连接的片段大小约为2kb，结果示挑取的10个克隆中有3个其片段大小与预期一致；这3个克隆中有2个其DNA测序结果与已获得的预期序列一致，表明其中srtA基因从起始密码子至终止密码子被完全删除，上下游无缝连接（图3）,说明本研究成功构建无标记的变异链球菌UA159菌株srtA基因缺失株。SrtA是最早从金黄色葡萄球菌中发现的一类重要转肽酶，在革兰阳性菌细胞壁生物合成、生物膜形成及致病能力方面均有重要作用［6,13］。研究［6］发现，srtA基因缺失的金黄色葡萄球菌毒力大幅减低，并且不能在组织中形成脓肿，在放线菌、链球菌、肠球菌、李斯特菌、芽孢杆菌等其他细菌中也有类似发现。在变异链球菌中，SrtA会识别P1、WapA、GbpC、Dex等表面蛋白C末端分选信号中的LPXTG基序，裂解其中苏氨酸-甘氨酸之间的肽键，并将这些蛋白共价连接到菌细胞壁上［1-2,4-5,13-15］。srtA基因缺失会导致上述变异链球菌表面蛋白的分泌、分布及功能异常，影响变异链球菌的初始黏附和生物膜形成，进而减低其致龋性［1-2,6］，因此srtA作为变异链球菌重要的毒力基因备受关注。目前研究变异链球菌基因定义突变的技术中，较成熟的主要有插入突变和带标记的等位同源突变，但插入突变常产生不完全的蛋白产物、用于等位同源替换靶基因的抗性基因片段本身可能携带启动子等因素都可能影响下游基因的表达及细菌表型［8-10］。无标记的基因缺失株构建技术如框内缺失法由于没有引入外源基因标记，很好地规避了对下游基因的极性效应，能更可靠地反映靶基因对转录代谢的影响［9］ 。Cre/loxP系统、温度敏感质粒或自杀质粒等技术常用来完成无标记缺失株的构建［9-10,12,16］，但Cre/loxP系统构建的基因缺失株仍会在细菌基因组中遗留一个loxP位点；温度敏感质粒和自杀质粒的应用则受到质粒种类和靶基因结构等多方面的限制，且上述方法都需要提取质粒并进行扩增，相对耗时较长，还有学者［10］ 认为在大肠杆菌中引入异种同源DNA片段可能会产生相关毒性。本研究通过设计部分反向互补引物，应用融合PCR构建同源片段，不需要质粒扩增，几小时内就可以获得目的片段，有效地提高了实验效率。pheS基因在大肠杆菌中编码苯丙氨酸-tRNA合成酶a亚基（PheS）,1994年Kast［11］发现点突变的pheS基因（pheS*）编码的产物PheS*在识别苯丙氨酸的同时还能酰基化苯丙氨酸类似物（p-Cl-Phe），其酰化产物会整合入菌细胞蛋白并产生细胞毒性，使pheS*转化子对p-Cl-Phe产生获得性敏感，这个特性随后被应用于突变株的阴性筛选［8,10-11,17］。Xie等［10］在分析变异链球菌PheS蛋白的氨基酸序列后，设计了变异链球菌特异性pheS突变基因一一mpheS，并将其与变异链球菌强启动子ldh、红霉素抗性基因片段ermAM相连，构成了IFDC2基因盒，可同时满足阳性和阴性筛选的需求，为框内缺失突变株的构建提供了新方法。相较于Xie等［10］在第二步转化中实现了93%~100%的阳性转化率，本研究中成功率仅为20%，推测原因可能为：本研究涉及的srtA基因表达水平不及Xie等实验中的靶基因nlmA等，在IFDC2基因盒替换srtA基因后，一些调控srtA表达的基因元件仍存在于染色体上，削弱了基因盒中mpheS的表达水平，使其蛋白产物不足以与受体菌正常产生的PheS竞争，一定程度逃避了p-Cl-Phe的细胞毒性，这也解释了为何第二步转化后，含有DNA片段组(a组)平板上菌落数与b、c组无明显差异。综上所述，在运用IFDC2技术构建突变株时，若靶基因表达水平较低或不稳定，在第二步转化后对平板上的阳性转化子进行PCR验证以及DNA测序是必要的，可以避免假阳性结果的产生。本研究使用融合PCR构建了包含IFDC2基因盒的srtA基因同源片段，在第一次转化中用IFDC2基因盒替换srtA基因，使转化子具有红霉素抗性；然后构建srtA基因上下游无缝连接的同源片段，在第二次转化中替换含有IFDC2基因盒的同源片段，使转化子能够在p-Cl-Phe环境中生长。最后DNA测序证明本研究成功构建了无标记的变异链球菌srtA基因缺失株，其中srtA基因编码序列被完全删除，实现了基因上下游片段的无缝连接，为进一步研究该基因在生物膜中的作用及其调控机制奠定了基础。【相关文献】[1]ZhuangPL,YuLX,TaoY,etal.EffectsofmissensemutationsinsortaseAgeneonenzymeactivityinStreptococcusmutans[J].BMCOralHealth,2016,16:47.LiaoS,KleinMI,HeimKP,etal.StreptococcusmutansextracellularDNAisupregulatedduringgrowthinbiofilms,activelyreleasedviamembranevesicles,andinfluencedbycomponentsoftheproteinsecretionmachinery[J].JBacteriol,2014,196(13):2355-2366.[3]LevesqueCM,VoronejskaiaE,HuangYC,etal.InvolvementofsortaseanchoringofcellwallproteinsinbiofilmformationbyStreptococcusmutans[J].InfectImmun,2005,73(6):3773-3777.LiMY,HuangRJ,ZhouXD,etal.RoleofsortaseinStreptococcusmutansundertheeffectofnicotine[J].IntJOralSci,2013,5^4):206-211.LapirattanakulJ,NomuraR,Matsumoto-NakanoM,etal.Variationofexpressiondefectsincellsurface190-kDaproteinantigenofStreptococcusmutans[J].IntJMedMicrobiol,2015,305(3):383-391.SchneewindO,MissiakasD.SecsecretionandsortasemediatedanchoringofproteinsinGrampositivebacteria[J].BiochimBiophysActa,2014,1843(8):1687-1697.[7]LeeSF,BoranTL.RolesofsortaseinsurfaceexpressionofthemajorproteinadhesinP1,saliva-inducedaggregationandadherence,andcariogenicityofStreptococcusmutans[J].InfectImmun,2003,71(2):676-681.KristichCJ,ChandlerJR,DunnyGM.Developmentofahost-genotypeindependentcounterselectablemarkerandahigh-frequencyconjugativedeliverysystemandtheiruseingeneticanalysisofEnterococcusfaecalis[J].Plasmid,2007,57(2):131-144.MerrittJ,TsangP,ZhengL,etal.Constructionofacounterselection-basedinframedeletionsystemforgeneticstudiesofStreptococcusmutans[J].OralMicrobiolImmunol,2007,22(2):95-102.Xie乙OkinagaT,QiF,etal.CloningindependentandcounterselectablemarkerlessmutagenesissysteminStreptococcusmutans[J].ApplEnvironMicrobio