托拉塞米产品中起始原料残留量分析方法的研究

托拉塞米产品中起始原料残留量分析方法的研究

曹晓燕姚勃万琼唐永丰

[摘要]目的：建立高效液相色谱法控制原料药托拉塞米中起始原料4-羟基吡啶与间甲苯胺的残留量的分析方法。方法：采用AgilentC18柱，以mol/L磷酸二氢钾溶液－甲醇(3∶2)为流动相，检测波长240nm，流速为ml/min，柱温为室温。结果：两种物质4-羟基吡啶浓度为~μg/ml，间甲苯胺浓度为~μg/ml的溶液的峰面积与浓度成线性关系，相关系数r≥；定量限和检测限试验中，信噪比符合规定，能够达到定量检测及检出的要求；各浓度下的4-羟基吡啶、间甲苯胺平均回收率均在90%～110%范围内，且9个回收率的RSD均小于%。结论：该方法专属性好，精密度、准确度都符合要求，方法可靠，可用于原料药托拉塞米中起始原料4-羟基吡啶与间甲苯胺的残留量的控制。

[关键词]托拉塞米；4-羟基吡啶；间甲苯胺；高效液相色谱

[Abstract]Objective：ToestablishaHPLCmethodtodeterminethecontentoftheresidualstartingmaterials,4-hydroxypyridineandm-tuloidine,intorasemidedrugsubstance.Methods：TheAgilentC18column(15cm×mm×μm)wasused.Themobilephasewasmethanol-dibasicpotassiumphosphate(2∶3).Thedetectionwavelengthwasat240nm.Theflowratewasml/min.Results：Thecalibrationcurveswerelinearwithintherangeof～μg/ml(r=8)for4-hydroxypyridineand～μg/ml(r=8)form-tuloidine,respectively.Theaveragerecoverieswere90%~110%(n=9)for4-hydroxypyridineandform-tuloidine,respectively．Conclusion：Themethodissimple，sensitive,accurateandsuitableforthequalitycontrolofthisdrugsubstance．

[Keywords]Torasemide;4-hydroxypyridine;M-tuloidine;RP-HPLC

托拉塞米(torasemide)化学名N-异丙基-[4-(3-甲基)苯胺基吡啶-3-磺酰胺基]甲酰胺，是1993年以来在欧洲许多国家上市的一种新型降压利尿药。在临床上广泛用于治疗高血压、心力衰竭、肾衰、慢性心力衰竭及肝腹腔积液等各种浮肿性疾病(如肝、肺、肾性水肿等)及尿崩症等[1]。

由于在托拉塞米的生产过程中用到4-羟基吡啶与间甲苯胺作起始原料，欧盟对各起始原料残留量有限量规定，为了有效地控制最终产品中这两种物质在托拉塞米产品中的残留，保证产品的质量与用药安全，本文采用高效液相法控制托拉塞米产品中4-羟基吡啶与间甲苯胺的残留量，分析方法灵敏、准确、可靠。

1仪器与试药

Agilent1100型高效液相色谱仪，包括四元梯度洗脱泵(在线自动脱气)、UV多波长检测器和Chemstation色谱工作站。4-羟基吡啶、间甲苯胺、托拉塞米析料药、磷酸二氢钾、甲醇、磷酸

2实验方法及结果

色谱条件及溶液[2，3]

色谱柱：C18，规格：Agilent15cm×mm×μm。

柱温：室温，流速：ml/min，检测波长：240nm，进样量：20μl。

流动相：mol/L磷酸二氢钾溶液－甲醇(3∶2)。

供试品溶液：精密称取本品20mg于50ml量瓶中，加15ml甲醇超声15min使溶解，再加mol/L磷酸二氢钾缓冲液ml，冷却至室温后，用流动相稀释至刻度，摇匀。

杂质对照贮备溶液：分别称取g4-羟基吡啶与间甲苯胺至50ml量瓶，用流动相溶解并稀释至刻度。则浓度为400μg/ml，再取此溶液1ml至10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，则浓度为40μg/ml。

杂质对照溶液：取杂质对照贮备溶液1ml至100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，则浓度为μg/ml。

系统适用性溶液：准确称取托拉塞米对照品20mg，置50ml量瓶，加ml杂质对照贮备溶液，用流动相稀释至刻度。

系统适用性及专属性

将流动相溶液、系统适用性溶液进样1针：4-羟基吡啶与间甲苯胺的分离度为，间甲苯胺及托拉塞米的分离度为，分离度均大于。

将杂质对照溶液进样6针，计算4-羟基吡啶、间甲苯胺峰面积的RSD分别为%、%都小于%，符合要求。空白溶液对检测无干扰。此项试验符合要求。各杂质在此试验条件下，得到了很好的分离。

重复性

准确称取托拉塞米样品6份约20mg，分别置于6个50ml量瓶中，加15ml甲醇超声溶解，再加ml的磷酸二氢钾缓冲液，冷却至室温，用流动相稀释至刻度。将上述6份样品各平行进2针，根据系统适用性项下的对照品溶液6针主峰面积的平均值，计算6份样品中的最大单杂质及杂质总和。6份样品的最大单杂质与总杂质含量的RSD均为0小于%。

检测限及定量限

制备含4-羟基吡啶μg/ml与间甲苯胺μg/ml的溶液，再逐级稀释，4-羟基吡啶与间甲苯胺的浓度稀释至信号与噪音的比约为10∶1时，为4-羟基吡啶与间甲苯胺的定量检测限，4-羟基吡啶的信噪比为∶1时的浓度为μg/ml相当于托拉塞米样品浓度的%；间甲苯胺的信噪比为∶1时的浓度为μg/ml相当于托拉塞米样品浓度的%。且定量限溶液峰面积RSD分别为%与%，均小于%。4-羟基吡啶与间甲苯胺峰的信噪比为3∶1的浓度，即为4-羟基吡啶与间甲苯胺检测限，4-羟基吡啶检测限浓度为6μg/ml相当于托拉塞米样品浓度的%，间甲苯胺检测限浓度为μg/ml，相当于托拉塞米样品浓度的%。

线性范围

溶液配制精密称取4-羟基吡啶与间甲苯胺用流动相配制成为浓度分别为μg/ml与μg/ml的溶液。精密移取贮备溶液、、、ml置100ml量瓶中，配制成线性溶液。各溶液平行进样3针，加上定量限，以样品浓度与峰面积做回归。

测定结果4-羟基吡啶的线性方程为：Y=+6相关系数r=9。间甲苯胺的线性方程为：Y=+4相关系数r=1。4-羟基吡啶浓度在~μg/ml[相当于托拉塞米样品溶液的%(定量检测限)~%]的溶液的峰面积与浓度成线性关系，相关系数r≥。间甲苯胺浓度在~μg/ml[相当于托拉塞米样品溶液的%(定量检测限)~%]的溶液的峰面积与浓度成线性关系，相关系数r≥。

准确度试验

回收率贮备溶液制备精密称取4-羟基吡啶与间甲苯胺用流动相溶解制成浓度分别为μg/ml与μg/ml的溶液。

回收率溶液的配制称取托拉塞米20mg三份，并分别加入相应量的贮备溶液得到3个浓度4-羟基吡啶与间甲苯胺浓度相当于样品溶液的%、%、%回收率1、回收率2、回收率3，各样品平行进3针，计算4-羟基吡啶、间甲苯胺回收率结果见表1，2。

分别为%、%、%和%、%、%。各浓度下的4-羟基吡啶平均回收率均在90%~110%范围内，间甲苯胺平均回收率均在85%~115%范围内，两种物质三个浓度回收率12个数据的相对标准偏差分别为%和%均不大于%。此试验符合要求。

稳定性

取重复性中的一份样品溶液存放并在5、11、22、48h平行进2针，计算其杂质含量。与0h比较考察溶液的稳定性。在5、11、22、48h样品杂质含量，杂质含量的绝对值均在±%以内，没有出现新的大于定量检测限的杂质。

3讨论

本方法参照了EP5和USP29中托拉塞米有关物质分析方法，选用mol/L磷酸二氢钾溶液－甲醇(3∶2)做流动相，波长240nm。

4-羟基吡啶浓度在~μg/ml[相当于托拉塞米样品溶液的%(定量检测限)~%]的溶液的峰面积与浓度成线性关系，相关系数r≥；间甲苯胺浓度在~μg/ml[相当于托拉塞米样品溶液的%(定量检测限)~%]的溶液的峰面积与浓度成线性关系，相关系数r≥；定量检测限和检测限试验中，信噪比符合规定，能够达到定量检测及检出的要求；各浓度下的4-羟基吡啶，间甲苯胺平均回收率均在90%～110%范围内，三个浓度回收率9个数据的相对标准差均不大于%；样品溶液放置5、11、22、48h均是稳定的；在整个测试系统中，对照溶液的RSD都小于10%，验证过程中测试系统是稳定的。

因此，本方法针对托拉塞米中起始原料4-羟基吡啶与间甲苯胺均不大于%进行控制具有可行性，能有效地控制托拉塞米成品中4-羟基吡啶与间甲苯胺的残留量，保证产品符合质量标准。

[参考文献]

[1]S