微生物生长繁殖

关于微生物生长繁殖第1页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三本章内容一、生物生长的测定1.以数量变化对微生物生长情况进行测定2.以生物量为指标测定微生物的生长二、

细菌的群体生长繁殖1.生长曲线2.同步培养3.连续培养三、

微生物生长繁殖的控制1.控制微生物生长的化学物质2.控制微生物生长的物理因素第2页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三要求：通过本章的课堂教学，使学生了解微生物生长繁殖的规律，掌握微生物生长的测定方法，及各种物理、化学因素对微生物生长的影响。

第3页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三一、生物生长的测定（一）微生物生长概述（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定（三）以生物量为指标测定微生物的生长要求：掌握微生物生长的常规测定方法（原理和操作）

第4页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三一、生物生长的测定生长：个体体积的增加繁殖：个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。细菌太小，往往讨论其群体生长。（一）微生物生长概述第5页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三一、生物生长的测定细菌个体生长包括细胞结构的复制和再生、细胞分裂和控制。（一）染色体复制和分离双向复制复制附着点在CM上，随CM生长和细胞分裂而分离，形成两个子细胞。（一）微生物生长概述第6页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三一、生物生长的测定（二）CW扩增杆菌中是新合成的肽聚糖在新旧Cw均有分布，而球菌是在赤道板插入，固定位置。（三）细菌分裂与调节各种物质复制后，质膜内陷伴随新肽聚糖插入，导致横隔壁向心生长，最后会合，一分为二。调节主要依赖转肽酶和D，D－羧肽酶活性比。转肽酶活性高些，利于CW扩增，导致细菌生长。羧肽酶高些，利于横隔壁形成，导致细胞分裂。第7页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三一、生物生长的测定第8页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三一、生物生长的测定微生物生长的测定：个体计数：生物量测定：重量测定、生理指标测定（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌）第9页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三一、生物生长的测定1、稀释平板计数法对样品进行适当稀释→

单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖→

肉眼可见的菌落→

对菌落数目的计数推测样品中的微生物细胞数（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定第10页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三一、生物生长的测定2、涂布平板法使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！（一般0.2ml）（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定同一稀释度三个以上重复,取平均值；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；样品充分混匀；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；要求：每ml活菌数＝同一稀释度平均数×稀释倍数×5注意：要三个以上重复平板平均计数；不适合丝状菌第11页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三一、生物生长的测定3.显微镜直接计数法采用细菌计数板或血球计数板，显微镜下直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定每ml原液含菌数＝每小格平均菌数×400×1000×稀释倍数第12页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三一、生物生长的测定显微镜直接计数法缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；第13页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三一、生物生长的测定（三）以生物量为指标测定微生物的生长1、比浊法在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。注意：测量应在菌浓度与O.D.成正比的线性范围内，否则不准第14页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三一、生物生长的测定2、重量法以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法（三）以生物量为指标测定微生物的生长第15页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三一、生物生长的测定3、生理指标法呼吸强度耗氧量酶活性与其群体的规模成正相关生物热样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。（三）以生物量为指标测定微生物的生长第16页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖生长曲线：细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。包括：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期1.迟缓期（lagphase）细胞分裂之前的准备，适应环境。将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。（一）生长规律第17页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三一条典型的生长曲线至少可以分为

迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期第18页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖延缓期特点：细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大；细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。（一）生长规律第19页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖减少迟缓期时间措施：（1）遗传学方法改变种的遗传特性（2）用对数生长期的做种子（3）接种前后培养基成分不要相差太大（4）适当扩大接种量（一）生长规律第20页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖2.对数生长期（logphase）这时的细菌代谢活性、酶活性稳定且高；大小一致；生活力强；用做种子和实验材料。3.稳定期（stationaryphase）生长率为0，菌数最多并维持稳定，积累代谢产物的好时期。（一）生长规律第21页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖对数期到稳定期的转变是细胞重要的分化调节阶段：

1）开始储存糖原等内含物；

2）形成芽孢或建立自然感受态（芽孢杆菌）

3）发酵过程积累代谢产物的重要阶段；

某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期（一）生长规律生产上延长稳定期的方法：补充营养物质（补料）或取走代谢产物；调节pH、调节温度；对好氧菌增加通气、搅拌或振荡第22页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖4.衰亡期（deathphase）特点：细菌代谢活性降低；细菌衰老并出现自溶；产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应（一）生长规律第23页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用(例如葡萄糖或NH+4等)；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（例如乳糖或NO3-等）。前者通常称为速效碳源（或氮源），后者称为迟效碳源（或氮源）。当培养基中同时含有这两类碳源（或氮源）时，微生物在生长过程中会形成二次生长现象。（一）生长规律第24页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generationtime)。代时通常以G表示。在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doublingtime)。（二）生长数学模型dNdt＝μNN：每毫升培养液中细胞数μ：比生长速率，每单位数量细菌在单位时间增加的量t：培养时间

t1–t00.639G=——————=—————nm第25页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖使群体中不同步的转变为同步生长或繁殖的方法。常用来科学研究和做种子。通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物。分为：机械法

环境条件控制法

（三）同步培养第26页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖1、机械法根据不同阶段细胞体积与质量或跟某种材料结合程度不同。（1）离心法（2）过虑分离法（3）硝酸纤维素膜法（三）同步培养第27页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法第28页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖2.环境条件控制法（1）温度（2）培养基成分控制（3）其他，如：光（三）同步培养由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。第29页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖采取一定措施使微生物以恒定比生长速率生长并持续。培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。（四）连续培养dNdt=μN菌数增加速率dNdt=DN菌数减少速率第30页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖D：稀释率，即培养基每小时流过培养容器的体积数μ>D，细菌数会增加，营养物消耗和代谢产物积累导致细菌停止生长。μ

＝D，维持平衡μ<D，菌被稀释（四）连续培养第31页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖连续培养两种类型：恒化器连续培养、恒浊器连续培养恒化：某种营养物质维持恒定恒浊：菌恒定（四）连续培养第32页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖恒浊器连续培养（四）连续培养测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；第33页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖恒浊器连续培养连续发酵优点：缺点：（四）连续培养一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；杂菌污染和菌种退化第34页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三二、群体生长繁殖恒化器连续培养使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。恒化连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，作为限制性因子，而其他营养物均过量。限制性因子必须是机体生长所必需的营养物质，如aa和氨等氮源，或G、麦芽糖等碳源或者是无机盐，一定浓度范围内决定细菌生长速率。（四）连续培养第35页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三三、环境对生长影响环境对生长影响1.营养物质2.水活性3.温度影响：酶活性、CM流动性、物质溶解度4.pH5.氧第36页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三四、生长繁殖控制控制（有害）微生物的生长速率或消灭不需要的微生物，在实际应用中具有重要的意义。抑制：亚致死剂量因子作用使生长停止死亡：生长能力不可逆丧失防腐：理化因素防止或抑制微生物生长消毒：杀死或灭活所有病原微生物灭菌：杀死包括芽孢在内的所有菌化疗：选择毒性化学物质对生物体内部感染组织或细胞进行治疗，对机体本身无毒害作用。第37页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三四、生长繁殖控制1.抗微生物剂（antimicrobialagent）杀死或抑制微生物生长的化学物质。分以下几种：抑菌剂（bacteriostaticagent）：抑制生长不能杀死杀菌剂（bactericide）：杀死不裂解细胞溶菌剂（bacteriolysis）：诱导细胞裂解（一）控制微生物的化学物质第38页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三四、生长繁殖控制消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。抗微生物剂又叫杀菌剂，分消毒剂和防腐剂。第39页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三四、生长繁殖控制2.抗代谢物生长因子的结构类似物干扰达到抑制微生物生长目的。如：叶酸对抗物（磺胺）、

嘌呤对抗物（6-巯基嘌呤）、苯丙氨酸对抗物（对氟苯丙氨酸）、尿嘧啶对抗物（5-氟尿嘧啶）胸腺嘧啶对抗物（5-溴胸腺嘧啶）等等第40页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三四、生长繁殖控制3.抗生素（antibiotic）某些生物合成或半合成的次级代谢产物或衍生物，抑制或杀死其他微生物。主要通过：抑制CW合成、破坏CM、作用呼吸链、抑制Pr核酸合成。第41页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三第42页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三第43页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三第44页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三第45页，讲稿共51页，2023年5月2日，星期三四、生长繁殖控制导致抗药性菌株：细胞质膜透性改变：使抗生素不进入细胞或进入细胞