免疫细胞的分离和检测课件

第十三章免疫细胞分离及检测技术SeparationandAssaysforImmunocyte

目的要求掌握免疫细胞分离与纯化的方法;淋巴细胞、吞噬细胞的功能检测的方法。熟悉淋巴细胞数量检测的方法与原理。教学内容1.

免疫细胞的分离与纯化2.

淋巴细胞的数量检测3.

淋巴细胞的功能检测4.

吞噬细胞的功能检测第一节免疫细胞的分离与纯化SeparationandPurificationofImmunocyte实验的目的；所需细胞的种类、纯度和数量；方法简便可行，尽量保持活性、纯度和收获率。一、白细胞的分离（一）自然沉降法利用血细胞自然沉降率的分离方法。（二）聚合物加速沉降法某些高分子聚合物（如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等）可使红细胞凝聚成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。(二）聚合物加速沉降法某些高分子聚合物（如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等）可使红细胞凝聚成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。二、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell)主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群。密度为1.075~1.090。分离液的基本要求

对细胞无毒基本等渗不溶于血浆或分离物质有一定密度密度梯度离心法

（densitygradientcentrifudation)Ficoll（商品名）成份：2份6%聚蔗糖（ficoll)水溶液+1份34%泛影葡胺（hypaque)生理盐水溶液。最常用的方法，分离纯度可达95%，细胞获取率80%。试验尽量在低温下进行（4℃~8℃或冰浴）。密度梯度分离单个核细胞（Ficoll分层液）

密度梯度分离单个核细胞（Ficoll分层液）

Percoll(商品名）经过聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒大小不一的混悬液。高速离心后，形成连续密度梯度，可将密度不同的细胞分离纯化。分离淋巴细胞纯度达98%，单个核细胞纯度达78%。流程长、烦琐、费用高。密度梯度分离单个核细胞（Percoll分层液）三、淋巴细胞的分离与纯化（一）红细胞的去除无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。

（二）血小板的去除离心洗涤2~3次。

PBMC悬液富含淋巴细胞，但有混杂有单核细胞、红细胞和血小板。(三）单核细胞和粒细胞的去除黏附法利用二者具黏附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶（SephhadexG-10)等特性。95%为淋巴细胞，活性大于95%。但损失部分B淋巴细胞。2.磁铁吸引法

PBMC吞噬直径3um的羰基铁颗粒，用磁铁将细胞吸至管底，上清即含较纯的淋巴细胞。3.Percoll分层液法密度梯度分离单个核细胞（Percoll分层液）四、T细胞和B细胞的分离(一）E花环沉降法成熟T细胞表面有SRBC受体（E受体），可和SRBC形成E花环，B细胞则无。但可活化T细胞。E花环(电子显微镜）（二）EA花环B细胞表面带有IgG

Fc段受体，AgAb复合物中IgG

Fc段牢固结合；这类红细胞抗体致敏的动物红细胞（EA)黏附在B细胞周围形成花环。（三）尼龙毛柱分离法利用B细胞和单核细胞具有黏附在尼龙（nylonwool)表面的特性。先洗脱出的事T细胞，再用培养也便冲洗边捻压塑料管，流出来的液体中主要含B细胞。T细胞纯度达90%，B细胞纯度达80%。四、细胞亚群的分离（三）荧光激活细胞分离仪分离法

(fluorescenceactivatedcellsorter,FACS)（一）亲和板结合分离法（二）磁性微球分离法亲和板分离淋巴细胞示意图磁性微球分离淋巴细胞示意图五、细胞的保存及活力测定保存

10%~20%的灭活小牛血清等渗培养液重悬。

短期置4℃，长期：二甲亚砜+-196℃活力测定台盼兰染色死细胞呈蓝色，活细胞不着色。第二节淋巴细胞表面标志的检测

及亚群分类

AssaysforLymphocyte

SurfaceMarkerandSubpopulations不同淋巴细胞表面有特定的标志，可用于对不同淋巴细胞的鉴定和计数。常用方法间接荧光免疫法、酶免疫组组化学法、微量细胞毒试验、花环技术等。一、淋巴细胞表面标志二、T淋巴细胞表面标志的检测

三、B淋巴细胞表面标志的检测

四、NK细胞表面标志的检测

NK(naturekiller

cell)

CD3-、CD16+、CD56+

第三节淋巴细胞功能检测技术

AssaysforLymphocyte

Function

一、T细胞功能检测（一）T细胞增殖试验

T细胞在体外受有丝分裂原或抗原刺激后，细胞代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应。如细胞变大、胞质增多、出现空泡、核质疏松、核仁明显并转化为淋巴母细胞，又称淋巴细胞转化试验（lymphocytetransformationtest,LTT)体外刺激物特异性刺激物：PPD、肿瘤抗原、同种异体细胞等。非特异性刺激物：PHA、ConA、PWM。最常用PHA，T细胞对特异性和非特异性抗原识别过程不一，但分裂和增值过程相同。

转化的淋巴细胞

200淋巴细胞转化率=（一）形态法正常值：60%~80%小于50%可视为降低X100%成熟淋巴细胞转化淋巴细胞转化淋巴细胞（二）3H-TdR掺入法SI=刺激管cmp/对照管cmpSI(stimulationindex)刺激指数

cmp

（每分钟脉冲数）正常值SI>2(三）MTT比色法SI=试验管OD均值对照管OD均值二、B细胞功能检测（一）B细胞增殖试验刺激物EBV、抗IgM、LPS、

PPD、PWM、IL-2、IL-4。（二）溶血空斑试验（三）酶联免疫斑点试验（四）体内试验三、NK细胞功能检测人K526细胞株小鼠YAC-1细胞株第十四章

吞噬细胞功能检测

AssaysforPhagocyteFunction第一节中性粒细胞功能的检测AssaysforPolymorphonuclearFunction一、细胞运动功能的检测（一）体内实验法（二）体外试验法二、吞噬和杀菌功能的检测（一）细胞内杀菌功能的检测吞噬率=吞噬指数=吞噬细菌的白细胞数计数的白细胞数X100%吞噬细菌总数

计数的白细胞数胞内含着色菌体的细胞数杀菌率=计数的白细胞X100%正常值吞噬率61%~64%吞噬指数接近1大肠埃希菌〉90%，金黄色葡萄球菌〉85%第二节巨噬细胞功能的检测

AssaysforCello