细胞工程的理论基础

第二章细胞工程的理论(lǐlùn)基础山东师范大学生命科学学院(xuéyuàn)第一页，共六十六页。精选ppt动物细胞与组织培养（cellandtissueculture）是动物细胞工程(gōngchéng)的重要技术基础。动物的细胞与组织培养是指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。第二页，共六十六页。精选ppt组织培养的概念(gàiniàn)组织培养这一名词实际上是一个通用名词，习惯上泛指所有的体外培养。根据培养物的不同可概括为三个不同概念：细胞培养、组织培养和器官培养。第三页，共六十六页。精选pptA：细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮(xuánfú)状态培养的技术称为细胞培养。第四页，共六十六页。精选pptB：组织培养：将活体的一小片组织放在盛有培养(péiyǎng)液的玻璃或塑料培养(péiyǎng)器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称为组织培养(péiyǎng)。从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时也发生移动，至使组织培养难以长时间维持其原有结构，结果也就成了细胞培养。第五页，共六十六页。精选pptC：器官培养：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活(cúnhuó)、生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。第六页，共六十六页。精选ppt体外培养(péiyǎng)的种类第七页，共六十六页。精选ppt二、细胞培养的现实意义第八页，共六十六页。精选ppt

生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹症等病毒疫苗，表皮(biǎopí)生长因子及干扰素、白细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾病的治疗等第九页，共六十六页。精选ppt三、细胞培养的优点(yōudiǎn)第十页，共六十六页。精选ppt

1.研究的对象是活细胞

在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测(jiǎncè)甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。

第十一页，共六十六页。精选ppt

2.研究条件可以人为控制

可以根据需要，控制包括pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，同时，可以施加化学、物理、生物等因素(yīnsù)作为条件而进行实验观察，这些因素(yīnsù)同样可以处于严格控制之下。第十二页，共六十六页。精选ppt3.研究的样本可以达到比较均一性

通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一(tóngyī)类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。第十三页，共六十六页。精选ppt4.研究内容便于观察、检测和记录

采用各种研究技术、记录方法：

研究:倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞(xìbāo)术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记--

记录:摄影照片、缩时电影、电视--第十四页，共六十六页。精选ppt5.研究的范围(fànwéi)比较广泛

学科多：细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等

对象广：

各种动物：低等动物--高等动物--人类

一种动物：不同年龄--

不同组织--

正常或异常（肿瘤--）

第十五页，共六十六页。精选ppt6.研究的费用相对较经济

可提供大量(dàliàng)、同一时期、重复性好的、生物学性状相似的实验对象第十六页，共六十六页。精选ppt四、细胞培养的缺点(quēdiǎn)第十七页，共六十六页。精选ppt

现人工模拟体内环境的技术(jìshù)已经很高,

但,人工所模拟的条件与体内实际情况

仍不完全相同.

当细胞被置于体外培养后,

生活在缺乏动态平衡的环境中,

久了，必然发生变化.第十八页，共六十六页。精选ppt

因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既能保持(bǎochí)动物体内原细胞一定的性状、结构和功能又具有某些改变的特定的细胞群体，而不能将之与体内的细胞完全等同。第十九页，共六十六页。精选ppt五、细胞培养的工作(gōngzuò)原则第二十页，共六十六页。精选ppt有标准化的工作方法培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、HANKS液及抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程(guīchéng)行事，配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等。一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放。第二十一页，共六十六页。精选ppt第二节组织培养的细胞(xìbāo)生物学第二十二页，共六十六页。精选ppt一、体内外细胞的差异(chāyì)和分化第二十三页，共六十六页。精选ppt（一）体内外细胞的差异

培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现(chūxiàn)类似“反祖”现象；表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。第二十四页，共六十六页。精选ppt1.与体内主要不同

相对孤立、相对单一

缺乏体内的系统作用、失去神经体液(tǐyè)的调节

和细胞相互间的影响

第二十五页，共六十六页。精选ppt2.主要(zhǔyào)表现

失去原有组织结构和细胞形态

分化减弱或不显

细胞趋向单一化；3.提示

要正确认识体外培养细胞

是一种特定条件下生长的细胞群体。

第二十六页，共六十六页。精选ppt（二）培养细胞的分化1．不适应(Deadaption)：表现为，细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，如肝细胞产生酪氨酸转移酶(TyrosineAminotranserase)特性的丧失.2．脱分化或去分化(Dedifferentiation)细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化的能力。第二十七页，共六十六页。精选ppt第二十八页，共六十六页。精选ppt二、培养细胞(xìbāo)形态分类第二十九页，共六十六页。精选ppt体外细胞培养物的生长(shēngzhǎng)类型

按生长方式:2型

粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。

悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。

绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数(shǎoshù)细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。

第三十页，共六十六页。精选ppt贴附(粘附(zhānfù))型细胞

粘附:是大多数有机体细胞在体内

生存和生长发育的基本存在方式含义两方面结果基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织(zǔzhī)，

有机体的绝大多数细胞必须

粘附于一固相表面

才能生存和生长。

第三十一页，共六十六页。精选ppt培养时：这些(zhèxiē)细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞第三十二页，共六十六页。精选ppt

类型

细胞在体内、外的粘附方式：存在差异(chāyì)

体内：粘附是全方位

外形具有复杂的立体特征

体外：多数情况，细胞只有一个附着平面

外形一般与体内时明显不同

按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为几大类型

第三十三页，共六十六页。精选ppt分类

根据形态大致的不同，主要(zhǔyào)2类：

上皮细胞型成纤维细胞型

其它，不定型第三十四页，共六十六页。精选ppt上皮细胞型

名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于--来源：来源于外胚层，内胚层(pēicéng)细胞

如：皮肤及其衍生物消化道，乳腺，肺泡上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞

扁平，不规则多角形，中有圆形核

第三十五页，共六十六页。精选ppt生长(shēngzhǎng)特点

易相连成片相靠—紧密相连—成薄层—

铺石状

生长时呈膜状移动

很少脱离细胞群而单个活动

体外培养(péiyǎng)细胞类型（1）——上皮细胞型第三十六页，共六十六页。精选ppt成纤维细胞型

名称(míngchēng)：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织

如：真正的成纤维细胞心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态

胞体梭形或不规则三角形

胞质向外伸出2—3个长短不等的突起

中有卵圆形核第三十七页，共六十六页。精选ppt生长特点

排列成放射状，漩涡状

并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而

单独行动游离的单独的成纤维样细胞，

常有几个伸长(shēnchánɡ)的细胞突起体外培养细胞(xìbāo)类型（2）——成纤维细胞(xìbāo)型第三十八页，共六十六页。精选ppt贴附生长(shēngzhǎng)型--类型1.与体内同名的细胞不完全相同

如：形态相似的成纤维细胞，可不同来源

自同一动物不同组织的成纤维样细胞相似但

发展趋向不同2.培养细胞的形态不稳定

条件(tiáojiàn)改变，细胞形态可有变化

第三十九页，共六十六页。精选ppt培养细胞形态不稳定(wěndìng)

血清Hela高血清低血清

成纤维细胞样上皮样细胞

pH

Hela太酸或太碱标准pH

成纤维细胞样上皮样细胞

细胞密度3T3低密度高密度

成纤维细胞样上皮样细胞

生长状态改变

悬浮或贴附悬浮贴附

圆形成纤维或上皮样

转化与否未转化转化后

成纤维样可成上皮样第四十页，共六十六页。精选ppt悬浮(xuánfú)生长型

概念(gàiniàn)

培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长

或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源

自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞也可能特点

在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团第四十一页，共六十六页。精选ppt优点

生存空间大，提供数量大传代方便(不需消化)易于收获可获得稳定状态缺点观察不方便很多细胞不能悬浮(xuánfú)生长(尤以正常细胞)

第四十二页，共六十六页。精选ppt三、培养(péiyǎng)细胞的生长特点第四十三页，共六十六页。精选ppt（一）贴附（二）接触抑制（三）密度(mìdù)抑制第四十四页，共六十六页。精选ppt四、培养细胞(xìbāo)的生长和增殖过程第四十五页，共六十六页。精选ppt（一）组织培养细胞(xìbāo)生命期(LifeSpanofCultureCells)所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长(shēngzhǎng)的时间。包括原代培养期、传代培养期及衰退期。第四十六页，共六十六页。精选ppt正常(zhèngcháng)培养的细胞周期第四十七页，共六十六页。精选ppt原代培养(péiyǎng)(PrimaryCulture)期也称初代培养(péiyǎng)，即从体内取出组织接种培养(péiyǎng)到第一次传代阶段，一般持续1-4周。特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与体内原组织在形态结构和功能(gōngnéng)活动上相似性大。第四十八页，共六十六页。精选ppt传代(chuándài)期特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞(xìbāo)增殖旺盛，并能维持二倍体核型。传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器(róngqì)，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系（CellLine）。第四十九页，共六十六页。精选ppt衰退期特点：此期细胞(xìbāo)仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。第五十页，共六十六页。精选ppt（二）体外培养细胞(xìbāo)一代生存期潜伏期指数增生(zēngshēng)期停滞期所谓细胞的“一代(yīdài)”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。第五十一页，共六十六页。精选ppt（三）单个细胞(xìbāo)的生长过程第五十二页，共六十六页。精选ppt五、体外培养细胞(xìbāo)的遗传学特征（一）核型变化(biànhuà)（二）永生(yǒngshēng)化和恶变（三）细胞性别第五十三页，共六十六页。精选ppt六、体外培养(péiyǎng)细胞的生存环境（一）无污染环境(huánjìng)（二）温度(wēndù)（三）气体环境和氢离子浓度第五十四页，共六十六页。精选ppt七、体外培养(péiyǎng)细胞生存所需基本物质（一）糖（二）氨基酸（三）维生素（四）促生长因子（五）其它(qítā)物质第五十五页，共六十六页。精选ppt第三节建立(jiànlì)细胞系或细胞株第五十六页，共六十六页。精选ppt一、体外培养(péiyǎng)细胞的种类和命名（一）初代培养初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦(yīdàn)已进行传代培养(5ubculture)的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。第五十七页，共六十六页。精选ppt（二）细胞系初代培养(péiyǎng)物开始第一次传代培养(péiyǎng)后的细胞，即称之为细胞系。有限(yǒuxiàn)细胞系无限细胞系第五十八页，共六十六页。精选ppt(三)克隆细胞株

从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选购方法(fāngfǎ)，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。第五十九页，共六十六页。精选ppt

(四)二倍体细胞培养细胞染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同(2n细胞占75＞或80％以上)的细胞群，称二倍体细胞培养。二倍体细胞在正常情况(qíngkuàng)下具有限生命期，故属有限细胞系。第六十页，共六十六页。精选ppt(五)肿瘤(zhǒngliú)细胞系或株是现有细胞系中最多的一类，我国已建立细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈上皮细胞型，常已传几十代或百代以上(yǐshàng)，并并具有不死性和异体接种致瘤性。第六十一页，共六十六页。精选ppt对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解，今列举以下几种代表性的细胞名称供参考；HeLa：为供体患者的性名(来源于宫颈癌)CHO：中国地鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvary)宫—743：富颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3；美国国立卫生(wèishēng)研究所(NationalInstituteofHealth)建立,每3天传代一次，每次接种3×106细胞／毫升。（六）细胞系或细胞株的命名(mìngmíng)第六十二页，共六十六页。精选ppt二、建立(jiànlì)细胞系（或株）的要求（一）组织来源（二）细胞(xìbāo)生物学检测（三）培养条件和方法第六十三页，共六十六页。精选ppt三、已建立(jiànlì)细胞系或株的签定、管理和使用培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等。冻存液：培养基和防冻液名称。细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性。培养液：培养基种类和名称(一般要求不含抗生素)，血清来源和含量。细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等。核型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无。无污染测验：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒(bìngdú)等。物种检测：检测同功酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染。免疫检测：一两种血清学检测。细胞建立者：建立者性名；检测者姓名。第六十四页，共六十六页。精选pptC1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%nWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdLH5E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0zoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkSdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQe7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9D2A-x*t$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL91z-w*t!qYmVjSgOdLaI6Ft$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjy(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkSdL9I6E3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5Dw&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXhQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXleMbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8rZnWkTdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3CqZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+!qYmVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2*t$qZnVk4D1A-w*t$qYnVjSgv&s!pXiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qZnVkSL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*pUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkSh