高效液相色谱法

2023/7/3第三章

高效液相色谱法一、HPLC的特点featureofHPLC二、高效液相色谱仪instrumentofHPLC三、流程及主要部件generalprocessandmainassemblyofHPLC第一节

高效液相色谱

的特点与仪器highperformanceliquidchromatography(HPLC)featureandinstrumentofHPLC2023/7/3一、高效液相色谱法的特点

featureofHPLC

特点：高压、高速、高效、高灵敏度高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2023/7/3二、高效液相色谱仪器instrumentsofHPLC2023/7/3液相色谱仪（2）2023/7/3液相色谱仪（3）2023/7/3液相色谱仪（4）2023/7/3三、流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程图动画演示2023/7/32.主要部件高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统；此外还有一些附属设备，如梯度洗脱、自动进样及数据处理装置。(1)

高压输液系统高压输液泵：恒流泵和恒压泵压力：150～350×105

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2023/7/3（a）恒流泵：往复式柱塞泵要求：应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。动画演示20寄23钞/6洒/2店6特点叙：流观动相冬无脉病冲、像流量睛稳定抢；液堡缸的促体积寸大，息更换桂流动争相不氏易，酱不适阿宜梯岸度洗刷脱。（b）恒输压泵架：气污动放低大泵p1SA=p2SB动画粘演示20久23乡丰/6灯/2纺6(c)梯度苹洗脱犬装置轰（梯倚度洗雄提、咏梯度宴淋洗程）所谓重梯度选洗脱疏就是杯流动辱相含谁有两边种或筝两种拣以上不同吉极性的溶蓝剂，在蚁分离堂过程蜂中按康一定程序连续殖改变流动朵相的配比伙和极愉性，以立此来改变流被分搅离组云分的容量肠因子k和选爱择性逆因子，达申到缩短尼分析魔时间梯和提级高分务离效艰果的目雪的。20粪23萝/6嫁/2士6高压旷梯度班洗脱诉:绵内梯笨度利用慢两台厨高压有输液绪泵，硬将两逐种不强同极践性的坟溶剂各按一沾定的株比例稻送入划梯度财混合台室，血混合响后进凑入色萄谱柱牧。低压监梯度袋洗脱祝:幸外梯暑度一台浇高压净泵，裤通过心比例批调节卷阀，镰将两魔种或施多种腥不同脸极性卵的溶疲剂按小一定较的比喇例抽副入混要合器垦中混绕合。20糕23究/6动/2举6（2）进酸样系侵统注射爆器进援样、鸟高压储六通虹阀进绳样。动画候演示20齿23漂/6映/2卧6(3)分离惩系统柱体算为直录型不床锈钢赤管，坚内径2～6mm烟，柱长10～50陵c狮m。发展疯趋势祸是减岂小填翅料粒享度和余柱径路以提恶高柱纪效。20筛23鸭/6洲/2倒6在液球相色俭谱中翅，有奥两种婆基本拘类型居的检屠测器敬。一洞类是溶质懒性检扛测器，它列仅对闪被分撒离组景分的猴物理斧或化窑学特升性有耕响应课，比翼如紫同外、灯荧光锐等检芽测器妥。另贷一类桐是总体户型检丛测器，它趁对试妨样和酱流动猛相总隔的物边理或装化学凉性质伪有响双应，刘比如擦示差训折光氏，电艺导检贫测器巨等。(4)检测味系统20迟23掠/6剥/2羞6应用柄最广背，对佣大部咏分有以机化君合物鸣有响煌应。灵敏想度高内，10-9g/虎mL门;流通眨池可毯做的阳很小伴（1mm捏×窝1须0m树m管，容积伤8μL统）；对流纷动相地的流牵速和浆温度跨变化腐不敏圆感；界可用宅于梯冈度洗迎脱。临波长可可选右，易酷于操邻作。动画辩演示a.紫外江光度色检测客器ul董tr源av汗io粉le略t送ph短ot禾om祖et椒ri糠c矮de况te领ct众or20纱23烫/6血/2辅620奇23泛/6诊/2津6b.光电雀二极允管阵誉列检危测器ph夕ot攀od祥io输de拦a洋rr层ay滋d被et筝ec登to赞r紫外棒检测行器的原重要表发展奏；由摆10蝇24公个二仇极管见组成园，各户检测异特定搅波长觉，计脸算机帮快速述处理豪，三争维立袍体谱心图，姐如图随所示内。20善23像/6圆/2胖6光电狸二极蛾管阵替列检柱测器洗获得爸的色竞谱图20各23助/6熟/2芳6c.荧光捎检测丽器fl复uo斗re糕sc套en折ce盏d乔et遗ec蜂to替r高灵唯敏度郑、高赖选择桃性；对多散环芳伯烃，节维生谜素B、黄曲钓霉素复、卟给啉类却化合热物、盈农药村、氨熊基酸旋类化俱合物语等有栏响应晚。激光昌诱导帆荧光(L赏IF拆)Las粒erInd检uc案edFlu士or完es勤ce渣nc动e体积执小，谨适合宋毛细财管柱20舱23爱/6扭/2趟6d.示差融折光丢检测葛器di抗ff垄er哲en仗ti脂al喂r代ef挂ra扬ct阁iv诞e票in矩de梢x尚de概te众ct围or除紫药外检忧测器汇之外门应用清最多舰的检由测器初；通用针型检委测器（每搭种物浙质具稳有不市同的笑折光嗓指数诞）；可连检续检观测参遭比池昌和样界品池唐中流皆动相份的折政光指背数差料值，大差值慎与浓储度呈炕正比恶。灵敏浸度低腔、对野温度劝敏感快、不田能用扎于梯配度洗冶脱；偏转宗式、辫反射俯式和跑干涉丽型三馋种；动画际演示20稀23贞/6铃/2鸭6e.电导灰检测皮器el壁ec毒tr很ic尚al苦c颂on赞du幼ct叉iv圣it盒y肠de跌te糊ct宪or根据迹物质婆在某远些介拒质中碍解离趟后所领产生松电导团变化传来测赖定解拒离物俱质的及含量娱。常知用于始离子咱色谱归分离浑系统垃中的存检测灭器。20肢23陷/6渴/2顷6f.蒸发披光散秋射检裳测器ev兼ap绍or最at忙iv躁e蒸li手gh责t得sc循at奥te聚ri搅ng据d刃et项ec盛to愧r基于耽不挥屿发溶册质对况光的雷散射旅现象搏来测暴定物昆质的最含量顺。通善用型甚检测谢器。溶剂督（流党动相墨）易糕挥发挽，灵朝敏度亦高，扎响应魄信号黎不受玩溶剂饺和温奶度的弱影响泛，可稀以用嘴于梯均度洗践脱。20盯23糕/6泪/2调6请选具择内杏容第一搜节雷高效想液相困色谱观的特诱点与鉴仪器fe夫at婚ur校e察an宿d盛in刑st似ru运me恋nt自o瞧f糠HP子LC第二罢节动主要焦的分感离类槽型和伐原理ma京in卷s鹊ep暑ar云at砌in串g幻玉ty貌pe扣s各an量d音pr保in祸ci炎pl盾e第三许节熔影响汇分离工的因质素与提操作箭条件窗选择fa沃ct长or挑s终in辰fl躁ue殊nc说ed显s魂ep辈ar拆at倚io竿n乎an援d雷ch肚oi导ce讨o摧f槐op忠er普at聋io美n汉co朋nd秩it昌io孔n第四柿节逼液相银制备萌色谱Pr境ep谁ar乌at群iv继e揭li哥qu戒id朽c随hr铲om壁at回og朵ra菊ph疑y第五炭节鸽毛细材管电邪泳Ca惑pi致ll最ar雪y丛el针ec烘tr孕op颈ho白re点si影s,候C橡E20降23忽/6哄/2桂6第三剃章次高效义液相周色谱过法一、长液-候液分课配色蒜谱li朵qu焰id译-l吧iq枝ui箩d昏pa陵rt刷it润io溜n丸ch宜ro甲ma声to瓦gr举ap过hy二、闸液-遥固吸障附色阵谱li弄qu霞id术-s蔑ol币id泪a势ds投or沈pt散io孟n偿ch桐ro达ma代to始gr晓ap茂hy三、丧离子圣对色锻谱Io柱n数pa摩ir箩c洲hr壳om沟at思og乓ra拉ph谢y四、侍离子注交换翅色谱io坊n讨ex拉ch加an第ge侄c家hr育om敌at珍og铲ra什ph肾y五、洋离子缺色谱Io俊n副ch永ro亩ma喷to巾gr厨ap慌hy六、灾尺寸绸（空棍间）炉排阻惰色谱si随ze耍-e撞xc疯lu吗si鼠on注c逆hr径om消at怒og柳ra醉ph建y七、呀亲和症色谱Af如fi纤ni架ty木c草hr竟om抚at顷og评ra共ph扰y第二掀节镇主要广类型飘和分撤离原辽理hi很gh鸭p黑er羽fo溉rm准an倾ce发l放iq前ui览d耻ch繁ro首ma县to恒gr系ap险hy葬(H加PL砖C)ma疤in巴t扬yp挡es扶a馋nd剖s伟ep擦ar元at政io址n急pr慕in姓ci鸟pl密e20荡23半/6尽/2闷6一、券液川－液响分配浪色谱li齿qu款id舞-l表iq缘瑞ui战d幕pa抢rt颤it活io盲nch测ro锅ma户to寇gr喝ap象hy固定慢相与勇流动边相均抛为液扶体（剩互不谣相溶格）1.基本麦原理斜：组分榜在两榨相上担的分哄配系烟数不惯同组分葱的分眨离顺包序取酷决于恳分配已系数K的大犬小。与气皆相色轨谱不按同的投是，院液相磨色谱章中的孤流动似相对骡分配屡系数元影响井较大写。20雄23黄/6呜/2冶62.固定逃相：表面垄多孔付型和良全多妈孔型。它们鬼具有液填料务均匀键、粒透度小州的优置点。20节23章/6杀/2纸6（1）涂桶渍固借定液由于勉液－题液分担配色曲谱中流动咽相参与徒选择亡竞争面，因且此对两固定例相选习择较冠简单颂。只表需使支用几豆种极休性不业同的揪固定苗液即醋可解鹊决分从离问堤题。最常毁用的谢强极暖性固遮定液β,疯β－－氧二眯丙睛曾，中蚂等极险性的邪聚乙股二醇恼，非洋极性严的角棍鲨烷恨等。20掩23腾/6说/2酿6（2）化寺学键们合固私定相秧：将不填同基设团通循过化笋学反急应键愤合到删硅胶遭（载当体）望表面少的游膊离羟部基上付。1.疏水镜基团虎：如块烷烃C8、C18和苯洪基等2.亲水趟基团健：如槐氨基切、氰漆基等20遇23茫/6跑/2啊63．键差合固苗定相伪的制羞备（l）硅丧酸酯槐（≡Si一OR）键狼合固残定相例，它券是最拼先用糠于液疏相色驰谱的戒健合饭固定合相。腔用醇佩与硅毛醇基榜发生魔酯化崇反应倦：≡Si－OH＋RO堤H耍→划≡S她i－OR＋H2O由于战这类穿键合要固定旁相的轿有机启表面似是一肚些单零体，肯具有林良好阁的传熄质特巾性，盒但这向些酯揪化过寨的硅础胶填公料易洁水解扑且受局热不摆稳定击，因箩此仅做适用错于不筐含水伸或醇殊的流靠动相撑。20朴23糟/6幼/2她6这类萍键合泻固定侦相（耽十八撒烷基残键合姐相）间具有恋热稳怀定好辉，不忍易吸肿水，供耐有梨机溶敌剂的保优点据。能性在70皮℃以下搭，pH＝2～8范围指内正捉常使语用，传应用缘瑞较广奸泛。（2）硅京烷化眉（≡Si－O－Si－C）键欲合固乐定相制备完反应渡如下却：20锹23卸/6荷/2港6对于裹亲水病性固蔬定液膜，通贝常采川用疏申水性贱流动涝相，沟即固使定相尝的极销性大缩慧于流初动相挣的极奥性，替称为正相到色谱狗；反之霜，固茎定相吊的极督性小端于流院动相你的极掠性的炒称为反相微色谱。4.流动料相：20塑23柱/6私/2精6正相讯色谱适用扮于极宝性化哥合物叉的分型离。独其流遣出顺族序是嘱极性涨小的倾先流庙出，嚼极性排大的炉后流将出。反相匀色谱适用晨于非皂极性鸽化合抚物的木分离缝，其旨流出攻顺序蚕与正某相色英谱恰孤好相壤反。20阁23誓/6佩/2堆65.正相避键合英相色盯谱法固定怜相采用昂极性凉的有堤机基牢团，CN、NH2、双团羟基愧等键笛合在验硅胶脸表面叙；流动诊相采用通非极怠性或午极性租小的厨溶剂伶（如熄烃类帜）中划加入活适量塞的极答性溶携剂（接如氯谨仿、欺醇、攻乙醇抖等）棉。它多唤用于忽分离坡异构怠体、扁极性晚不同仰的化换合物载，此壁时，晓组分婶的分粒配比k值随购其极赵性的惜增加扭而增窝大，闲但随我流动竹相极苹性的哈增加芳而降斧低。20光23锹/6盲/2倾66．反晕相健沃合相赖色谱稀法固定梦相是采偷用极蒸性较喇小的幅键合红固定忧相，拉如硅加胶－C18H37、硅浅胶－概苯基诵等；流动劲相是采青用极厉性较蔬强的欲溶剂艰，如的甲醇烂、乙纤睛－详水、死水和稍无机遍盐的栏缓冲卧溶液乞等。多用先于分喇离多雨环芳额烃等乡丰低极疾性化同合物液；反庄相键层合相乐色谱颤法具凝有柱雪效高愤，能迹获得彻无拖留尾色霞谱峰任的优煎点。20裤23防/6拨/2鼓6键合垃相色认谱的林优点：通替过改皂变流右动相古的组针成和侵种类控，可单有效贱地分摘离各却种类懒型化柄合物约（非民极性疗、极纽奉性和达离子稍型）残。此亏外，吃由于辰键合阵到载截体上狱的基半团不胶易流浓失，速特别兽适用贤于梯内度淋秤洗。最大漫缺点册：不能败用于鹿酸度便、碱牲度过马大或包存在辞氧化润剂的钢缓冲艺溶液劳作流蜓动相共的体芳系。总结啊：20梨23党/6豆/2钩6二、庭液扑－固袋吸附袋色谱li洒qu姜id岛-s璃ol蚊id独a父bs币or准pt猜io置nch委ro陪ma含to谎gr暑ap涌hy液固倍色谱底实质探是根侍据待谱分离齐的组婶分在蜓固定晒相上乎的吸垦附作持用不选同来狡进行染分离扩的。其作舟用机项制是右溶质誉分子拾和溶谣剂分抬子对器吸附券剂活拐性表狮面的孟吸附哀竞争鸟。20胖23滑/6郑/2貌6当流剃动相剖通过芒固定疑相（潮吸附找剂）部时，素吸附袋剂表勤面的净活性睡中心某就要基吸附性流动刊相分松子（M）。载当待起测试粗样分工子（X）被练流动波相带臭入色提谱柱兔内，屯就要饰取代和数目机相当岛的已严被吸狼附的宣流动爹相分须子，脂于是期，在朽固定巾相表觉面发更生交埋换（梢竞争桶）吸破附:Xm＋n汤Mad＝Xad＋nMm1．分要离原泻理20脑23僻/6告/2嘉6其中Kad为吸推附平粪衡常得数，珠值大饺表示获组分弟在吸互附剂启上保京留强索，难异于洗区脱。Kad值小马，则罢保留伙值弱凳，易嫂于洗辱脱，群试样障中各吼组分呈据此哨得以环分离攻。竞争嘱吸附走达平乔衡时左，有20环23猎/6干/2松62．固龙定相由于廊硅胶纠的优房诚点，安如线歉性容彼量高同，机锄械性卫能好痕，与便大多富数试幕样不絮发生疑化学事反应朵等，洞因此棋，以烫硅胶肢用得怀最多堵。20按23珍/6柿/2虹63.流动似相一般量把吸尼附色偶谱中和流动眼相称枝作洗闪脱剂谈。在留吸附骑色谱挨中对蚁极性昆大的击试样惧往往李采用匆极性论强的安洗脱犹剂；刚对极咽性弱石的试布样宜袖用极暖性弱刺的洗遭脱剂取。洗脱臂剂的箱极性厦强弱拆可用廊溶剂抽强度余参数违（0）来窑衡量街。0越大终，表名示洗扛脱剂退的极铃性越医强。课本p8悔1，常睛用溶概剂的啄极性衰顺序删。20崖23杏/6辈/2候6液固首吸附全色谱防适用司于分显离那骄些能扫溶解插在非妄极性絮溶剂睛中、悦具有散中等倒分子续质量开的非有离子信型（惕油溶叮性）呀的试粒样；耳对具奸有相雄同官术能团耕但数弱目不遥同的伍化合菊物或呜者异习构体洒也有挎较高弯选择基性；缺点：非妹线形海等温冒吸附著常引益起峰渴的拖娱尾；20恭23下/6态/2而6将一法种或设多种姐与溶导质离踢子电荷笛相反的离植子加缎入到伍流动贵相或罢固定产相中减，使含其与疼溶质乓离子六结合跟形成疏水蛾性的题离子抢对化合缴物，从墙而控贯制溶宅质的条保留闪行为祸的一沃种色悟谱分撞离方营法。三、龄离叔子对稼色谱彻法io歪n锦pa病ir批c心hr窑om国at躺og纤ra贼ph镇y对强侨极性移的有追机酸滤和有舒机碱墨的分貌离？20溪23贫/6恰/2戏6烷基观铵盐秤离子海对试剂飞，用权于阴球离子奥的分粘离；烷基灿磺酸巡寿盐离午子对试剂斑，用绣于阳比离子探的分爬离。固定硬相：正相游键合沾固定福相；反相寻键合陈固定详相。流动远相：一般健含有趋适当破有机饭反离蜂子的毒溶剂钟。1．固群定相群和流盼动相20贤23烤/6淘/2君62．分我离原络理固定野相为葵非极蔬性键徒合相监，流趟动相旧为水赛溶液腐，于丈流动暴相中御加入辈与待围测离店子X+相反乡丰电荷叼的离晕子Y-：20盏23东/6颂/2苦6由于斜离子集对X+Y-具有筋疏水幻玉性，竿因而书被非伪极性质固定置相提苗取。印其它挂待测轿离子X1，X2，X3……寇..因与Y-离子先间的湾成对嗓能力蜂不同收，而再形成晴不同案疏水刊性的眼离子撒对，版使得塘各待玩测物章在柱皆内的纹保留拦值不谨同，街从而泻达到臭分离唯的目冲的。20晨23裙/6糖/2樱6组分敌的保徒留值惜取决娃于组森分离葡子和塞离子毒对试间剂生骂成配合纳物的纷平衡贞常数和反离奖子的痕浓度。根据畏分配竖系数斑的定采义：20柿23崇/6袜/2星620拼23毙/6纸/2匠6离子稻对色粱谱对忍一些神生化抹试样粪，如塔核酸歌、核物苷、牧儿茶泪酚胺蒸类物胳质具造有良恐好的叙分离答效果冶。尤寒其是雄可以始借助并离子峰对的亮生成恋引入腹紫外爽吸收骗或荧忙光基脚团。20幻玉23土/6短/2网6四、垄离乖子交级换色念谱io酬n-株ex天ch蜂an胖gech厚ro读ma洒to区gr怖ap扑hy固定项相：阴离兆子交铸换树确脂或析阳离盈子交氧换树等脂；流动具相：盐类观缓冲射溶液都（一奖定pH和离恩子强协度）修。1．固纸定相夏和流寇动相20保23击/6建/2忙6基本末原理避：组分筝在固麻定相然上发改生离煌子交颗换反涉应；扫组分议与离旷子交盟换剂找之间籍亲和如力的矩大小宣与离旷子半医径、态电荷宗多少吴等有费关。凉亲和圈力大旗，保鲜留时时间长门。阳离炒子交拣换反水应：R-感SO3-Na++M+＝R-样SO3-M++Na+阴离啊子交瞒换反页应：R-兆NR3+Cl-＋X-＝R-体NR3+X-＋Cl-2．分惠离原承理动画红演示20丹23蛾/6顽/2球6在离隙子交残换色帖谱中嗓，常记通过功改变流动齐相的pH、离打子强山度等胆条件填来控平制分驴配比k，改恭变离韵子交周换剂坏的选站择性垄，进烧而影占响待葱测物屠的分过离。pH值：影响嚼酸或份碱的户离解医平衡唉，控戚制组孕分离偷子形黄式所斩占的接分数俱。离慌子分铃数越矿高，磨保留丈值越粪大。沸常用增的有嫁柠檬言酸盐障、磷鸣酸盐连、乙漆酸盐安和氨问水等资。20治23励/6希/2幼6离子朋强度I：组分著保留吴值受储流动将相中钱盐类默总浓乳度控衬制。拢额外怠增加督阳离月子或车阴离就子将践增加游它们丙对R-连SO3-Na+或R-壶NR3+Cl-的交驻换竞长争力此，使跳组分蚊保留痰值减樱小。启通过死加入催不同筒种类谱的盐抓，可件影响矮柱的猫选择抱性，钓因为煌不同社物质评对交哲换剂适的亲烟和能个力不切同。应用牢：它既犯适于驶无机手离子倡，也阿适于血有机拴物分狱离，舰如蛋嘱白质成、氨移基酸晓、核勤酸等拳。20顶23阵/6馅/2求6五、送离湖子色棵谱法io纺n斗ch族ro渡ma援to劈燕gr担ap缎hy传统易离子护交换铜色谱柿存在要着两茅个难志于解桥决的嘉问题朝：（1）需安要高敌浓度直淋洗太液且望洗脱参时间娃很长爬；（2）洗凯脱后桨的组沸分缺宿乏灵均敏、责快速活的在湖线检筹测方网法。20逝23听/6寇/2兆61.正离雅子色驰谱流哭程图20饼23威/6藏/2分6在离米子交黎换分篇离柱清后加焰一根抑制柔柱，抑岔制柱扁中装熟填与艺分离艳柱电荷殖相反的离捷子交荷换树赚脂。悲通过串分离丑柱后灶的样救品再客经过药抑制拍柱，锄使具萄有高诞背景联电导锐的流返动相绝转变势成低诸背景干电导馅的流士动相逃，从锅而用电导蔬检测恭器可直醒接检酷测各恨种离堵子的盈含量忽。这患种色科谱技妈术称帖为离子墙色谱锁法。2.骂离仗子色沉谱法胃原理20法23异/6针/2搂6若样如品为爽阳离泳子，土用无锤机酸庙（HC乞l）作虾流动汉相，狠抑制际柱为匪高容滥量的强碱腰性阴语离子榆交换吩剂（OH-）。当价试样柄经阳我离子骨交换善剂的弯色谱饶柱分羞离后雪，随字流动裕相进俊入抑环制柱瓜，在漫抑制毛柱中意发生萍两个或重要猜反应舒：R+－OH-＋H+Cl-→R+－Cl-＋H2OR+－OH-＋M+Cl-→翁R+－Cl-＋M+OH-20咳23波/6著/2补6由反启应可赵见：专经抑固制柱易后，酒一方理面将黑大量妨酸转调变为援电导猾很小贡的水储，消央除了土流动堆相本惩底（HC拜l）电仇导的弊影响轿。同纠时，范又将芳样品趋阳离楼子M+转变售成相铲应的世碱，财由于OH-离子欠的淌萍度为Cl-离子凑的2.喉6倍，沟提高马了所结测阳电离子参电导名的检轰测灵印敏度认。同理陈对于龙阴离父子样掏品也忽有相暖似的剃作用欲机理呜。20烈23刻/6怖/2涉6在分颜离柱狼后加夜一个旗抑制予柱的沾离子浪色谱鉴亦称乒为抑制当型离吗子色笋谱或是称双曲柱离陵子色悠谱。由于犯抑制逗柱要鲁定期兔再生劫，而雾且谱栗带在销通过雨抑制减柱后柜会加功宽，覆降低医了分抚离度财。后来碍，Fr拿it安s等提登出不响用抑雁制柱诸的离进子色萍谱体忆系，苦而采干用了鞠电导缎率极晌低的佩溶液瘦，例比如1～5×饥10-4mo船l·任L-1苯甲盲酸盐峰或邻件苯二庸甲酸统盐的乒稀溶染液作神为流河动相待，称谈为非抑扁制型杠离子冒色谱呼或单惠柱离惕子色样谱。20倍23啦/6密/2笛620锋23计/6妙/2盛6六、匙空磨间排松阻（帆尺寸烛排斥害）色象谱st姐er督ic紧-e逮xc革lu屠si藏on蔬c丹hr未om患at等og罩ra哑ph绣y原理：按分怜子大楼小分睛离。斧小分劝子可杯以扩骗散到少凝胶底空隙特，由忠其中制通过氧，出龄峰最搏慢；振中等杜分子常只能铃通过嗓部分济凝胶详空隙涌，中嚼速通懂过；便而大培分子粮被排片斥在他外，乓出峰祸最快君。动画降演示20车23央/6齐/2展6尺寸际排阻间色谱情被广留泛应引用于旧大分沾子物汪质相仰对分油子量战的分扬布。（1）保事留时抗间是呢分子适尺寸誉的函遮数，纺有可逝能提具供分融子结互构的册某些滨信息史；（2）固拼定相伍与分搂子间初作用辛力极陪弱，沾趋于探零。昨由于商柱子把不能璃很强雅保留这分子球，因芦此柱寇寿命蹲长；（3）不报能分且辨分托子大须小相露近的槽化合视物，盘相对遇分子肠质量斤差别茫必须祖大于10％才荡能得蜓以分副离。20得23杂/6摩/2堆6排阻叹色谱链固定红相种羞类很党多，舍一般锣可分菌为软性、半刚让性和刚性奴凝胶三类附。所谓迟凝胶狭，指抢含有邀大量诞液体膊（一记般是宰水）身的柔芹软而叠富于哨弹性旅的物豆质，危它是柿一种遗经过督交联啄而具省有立衡体网泪状结雄构的脸多聚陆体。1．固帽定相20歌23科/6航/2茎6如葡树聚糖暑凝胶方、琼狱脂糖隔凝胶队都具帖有较诉小的粗交联猾结构血，其难微孔秋能吸艰入大杂量的套溶剂电，并森能溶闸胀到丛它们伍干体概的许载多倍阀。它脱们适确用以宣水溶青性溶刑剂作眯流动地相，绑一般锹用于宁小分形子质膛量物羊质的扯分析丙，不帮适宜近用在牛高效本液相酷色谱麻中。（1）软传性凝喊胶20络23特/6残/2弹6如高凉交联桥度的举聚苯怖乙烯陵（St唇yr档ag膨el）比内软性当凝胶电稍耐甘压，跪溶胀雷性不各如软辅性凝流胶。常以杏有机前溶剂激作流例动相以。用羊于HP破LC时，拌流速卸不宜葱过大片。（2）半思刚性鹿凝胶20储23旅/6炒/2兵6如多顶孔硅酱胶、打多孔勒玻璃测等它处们既弃可用男水溶心性溶木剂，柄又可欢用有刮机溶皇剂作和流动吨相，糕可在阵较高搁压强屋和较屋高流沸速下秩操作洲。一般炸控制蛙压强啦小于7M该Pa，流恨速＜1c家m3·s-1；否柳则将梨影响秀凝胶轮孔径剂，造烈成不秋良分壮离。（3）刚习性凝侍胶20听23袖/6轧/2毫6排阻姐色谱袄所选欺用的货流动卸相必还须能妻溶解花样品垒，而盐且与盏凝胶压本身啊非常撇相似稼，这陡样才种能润学湿凝行胶。劣当采黑用软浴性凝漫胶时赵，溶腰剂也酬必须拴能溶否胀凝版胶。福另外疏，溶仓剂的侵粘度拳要小赢，因在为高繁粘度皆溶剂颈往往艰限制象分子胜扩散叛作用蒜而影耗响分膝离效垦果。子这对婆于具洁有低斑扩散房诚系数交的大速分子胞物质援分离贼，尤析需注峡意。2．流撒动相20管23损/6亏/2孙6选择梯溶剂串还必枣须与爸所用素的检胀测器耽相匹徐配。懂常用恐的流日动相仓有四划氢呋尼喃、息甲苯却、氯器仿、腾二甲存基酸妙胺和银水等倒。描以水渣溶液辈为流才动相新的凝头胶色赴谱适熟用于踪蝶水溶趣性样镇品，策以有眯机溶隶剂为叹流动固相的罗凝胶兴色谱刷适用捎于非枯水溶体性样束品。20吗23感/6决/2疏6请选原择内碧容第一辣节谋高效崭液相棍色谱荡的特颠点与拖仪器fe越at闪ur寇e驶an幸d术in谈st览ru闭me笑nt劝o怎f某HP纤LC第二宫节攀主要彩的分阵离类握型和讯原理ma块in商s下ep日ar莫at非in倒g宴ty静pe朵s作an陷d祸pr还in惕ci招pl洁e第三烘节吹影响理分离威的因亏素与来操作眨条件鸟选择fa歌ct竿or哭s乖in桶fl炸ue江nc牙ed瓶s托ep纲ar唤at扯io烈n提an西d摄ch退oi钥ce斯o缠f栽op没er疗at怖io沉n丈co傻nd蚊it碎io熊n第四圾节抬液相膀制备肯色谱Pr散ep馅ar洲at祖iv揉e稍li瓦qu臣id础c择hr屑om昏at精og吃ra涛ph筋y第五抖节尿毛细死管电搭泳Ca败pi叫ll爆ar肯y蜂el湾ec纹tr汪op与ho铅re依si督s,坡C橡E20屋23卖/6砌/2腔6第三琴章辣高效偏液相拿色谱勤法一、影响译分离杂的因边素in哗fl征ue惊nc躬ed见f偿ac培to肢rs际o荡f超se蒜pa粱ra妄ti隙on二、蜡分离乘类型棉的选稍择ch糟oi搂ce宫o微f诱se违pa启ra涌ti岔on端t稻yp搁es三、肤液相碰色谱券的应易用ap垦pl鸡ic谦at立io遇n疏of扩H爬PL泡C第三佣节纪影响破分离漫的因肾素象与操络作条星件的击选择hi径gh基p炼er烂fo萝rm子an排ce禁l争iq筝ui央d型ch刚ro会ma揪to鬼gr毕ap健hy他(H头PL玩C)In倦fl筋ue富nc植ed乖f壮ac宁to蛮rs廉o害f吩se姓pa改ra战ti凤on车a度nd戴c霞ho膛ic妄e沟of姿o斑pe数ra远ti擦on舌c养on茎di册ti冒on20的23洽/6匀/2粥6一、影响哗分离猴的因路素in柄fl谷ue刃nc魄edfa潮ct住or帖s励to惩s哨ep诵ar著at议io笨n在HP庭LC中，旱液体古的扩区散系侦数仅饿为气时体的赵万分捷之一稠，则敏速率拔方程喉中的夏分子择扩散妥项B/恋u较小然，可摊以忽岛略不慌计，充即：H＝A＋C·u故液娃相色工谱H-桂u曲线赛与气宁相色辽谱的蓄形状风有所萌差别俩，如跃右图蔽。1.剂影响循分离亲的因软素与卵提高冤柱效佛的途狭径20暴23武/6辜/2择6液体侵的黏翼度比灵气体搅大一吴百倍吓，密巴度为匀气体译的一陵千倍淹，故渔降低还传质程阻力典是提持高柱允效主拣要途畅径。咬由速羊率方越程可枝知，提高誓柱内筒填料军装填旬的均痒匀性烫和减逢小固概定相旨粒度可提隆高柱塞效。液相衔色谱夺中，非不可筋能通朱过增烦加柱穿温来织改善科传质净。恒盒温改蒙变淋柳洗液毕组成徐、极绒性是羞改善陈分离锡的最纷直接脆的因织素（梯度绕洗脱）。H妄=硬2dp+焦Cu20芒23永/6后/2锐62.悦流速流速私大于释0.菠5cm帽/s时，H～宰u曲线布是一由段斜垃率不蕉大的重直线蜜。降哀低流且速，贴柱效捧提高厚不是芽很大己。20枕23咽/6耕/2自6气相极色谱圾中的尝固定播液原邮则上贴都可肤以用牙于液拼相色活谱，歇其选乖用原俯则与眯气相副色谱疗一样决。但推在高宿效液南相色滨谱中刘，分折离柱抢的制编备是纵一项波技术渠要求卸非常越高的供工作摘，一斯般很乐少自写行制典备。3.便固科定相跌及分骂离柱20快23妹/6康/2吴6二、莫分离吃类型清选择ch抄oi炎ce映o炉f厦se张pa衣ra桐ti诊on优t前yp淋es20赞23扣/6袭/2谅6三、HP贪LC的应用（自贫行学纸习）ap盗pl益ic焦at青io保n哗of赢H亏PL鸡C1.旷环场境中慕有机食氯农担药残蹦留量怨分析固定接相：薄壳跨型硅备胶（肆37～5迫0m）流动苏相：博正己胃烷流甜速筛：1边.5mL膏/m跃in色谱涛柱：部50cm2悼.5芝mm（内苏径）检测夜器：季差示株折光洲检测撕器可对银水果捉、蔬童菜中基的农传药残挣留量知进行浙分析耍。20炸23壮/6破/2发62.财稠铲环芳娱烃的弱分析固定溉相：十八郑烷基鼻硅烷撇化键宴合相流动豪相：芬20谊%甲裹醇-水扬～1麦00菜%甲径醇线立性梯父度淋狱洗，2%滑/mi亲n流扶速寺：1mL般/m夕in柱泽温忧：5预0ºC柱妄压阳：7.0×1唉05Pa检测抵器：担紫外炉检测玻器20拨23轨/6黎/2复6请选继择内记容第一狂节练高效舞液相略色谱或的特站点与染仪器fe是at江ur傲e坚an脉d竟in柱st阁ru要me弟nt窜o蛇f洽HP垫LC第二炒节太主要堪的分航离类戒型和吵原理ma缺in站s州ep羽ar题at垫in院g葵ty含pe殿s赢an摔d且pr伐in付ci派pl潮e第三虫节博影响危分离焦的因待素与竟操作吃条件返选择fa图ct常or樱s扁in遭fl词ue箱nc客ed朝s展ep艺ar干at魂io缓n伞an杨d寨ch鞋oi劲ce易o虎f私op绒er农at夜io颜n崭co躁nd茫it杆io赵n第四护节笑液相恭制备恢色谱Pr看ep车ar躲at经iv盐e受li当qu填id惊c巡寿hr蜡om柄at承og允ra炮ph雨y第五掀节祸毛细补管电哗泳Ca修pi棚ll艘ar友y泻el蜜ec绸tr采op妖ho雄re庄si强s,匆C送E20沿23言/6筐/2洁6第三遥章貌高效蜜液相无色谱摆法一、截色谱棍柱的价柱容盾量in弊fl邮ue险nc有ed总f躁ac略to裳rs滚t籍o狠se兄pa抚ra耽ti久on二、厦液相茫制备晋色谱殖方法ch雷oi握ce肌o条f猛se朗pa牢ra妙ti证on失t沉yp额es三、雄液相音制备蚊色谱健仪ap旷pl纷ic阵at福io找n至of耕H劲PL慌C第四馆节为液相桐制备下色谱hi曾gh遍p鸟er恼fo赞rm窗an刮ce员l倾iq检ui撞d侧ch滋ro眼ma肯to还gr绵ap尊hy钉(H秃PL网C)Pr进ep幻玉ar乡丰at惊iv碌e景li地qu踪蝶id淡c露hr背om追at滥og赢ra啄ph惹y20蛾23个/6扰/2婆6制备昌色谱应是一威种分秧离纯来化手醉段。恐把高喊效液外相色喘谱的看色谱炮柱换羽成制荐备柱估，就假是制氧备液仓相色甘谱，尊两者灾的区早别在丝式于一倍种以寄分析座为目舰的，乌追求东的是降检测泪精度季，样件品承虑载量砌非常狱小；标制备毕色谱唐以分计离纯桨化为鞋目的乓，它谊追求严的是样品讯承载芬量，检峰测精源度很歼低，凤检测燥只用欧作鉴劫别即甜可。20仙23纠/6盾/2各6获得伞高纯凳物质访（色忌谱纯亮）的眯有效碑方法唐。收集太分离蝇后的厚柱后出流出绑部分话，色过谱峰累越宽婶越好咳。必男要时冰进行鞠二次捆分离泼和纯席化。对分忧析柱抄：不影个响柱伞效时的去最大丧进样辈量；对制毒备柱锯：不影抛响收叹集物愧纯度时的常最大朗进样锯量；超载阳：进队样量它超过贝柱容顺量。昌柱效根迅速卵下降兴，峰获变宽浆。超载锹可提逆高制附备效搜率，耀以柱底效下旺降一热半或武容量母因子k降低10臭%为宜岛。1.色谱换柱的搭柱容尝量（锁柱负副荷）2.液相制竖备色俘谱的奶方法收集兆组分隶时，浪通常表有以鸟下情蕉况：（1）可题获得厚良好餐分离漆，欲糕分离歉的组刘分呈桶现一敏个主浆峰使用微制备露柱，进超载端提高凤效率访；（2）两助个或需多个差主组装分；（3）两挠主成暴分之肥间的棍小组蛾分；超载聋，分迈离切宪分使泰待分偶离组交分成禁为主浪成分港（富螺集）惑后，泊再次务分离军制备苦。20钱23也/6栏/2杏620排23番/6火/2输63.液相制伙备色谱酬仪制备号型液俗相色俱谱：勤结构赴与分漠析型回一样勉，但参泵流非量大似、进院样量舌大、价采用暗制备果柱；充柱后怜馏分跳收集喘器。半制密备柱端（内世径10承mm，长踢度15～30疏cm），材一次窄制备刷量0.礼1～1.萄0m桥g；工业慎制备岗柱（裙内径50吵0m扮m，长富度不瞎一）经。20连23汉/6至/2骗6请选将择内讲容第一显节红高效箱液相舌色谱追的特造点与夏仪器fe陪at榜ur录e彩an筒d根in刑st惰ru世me量nt多o狠f屋HP栏LC第二辞节揉主要徒的分剧离类桌型和绸原理ma尊in毅s佳ep伶ar丧at眨in错g越ty带pe观s危an籍d想pr万in霸ci返pl斗e第三悉节话影响药分离腹的因荣素与抹操作翻条件狸选择fa樱ct讽or么s剖in慈fl菊ue瞒nc筛ed炒s孙ep坛ar横at填io接n判an迁d渠ch忌oi建ce询o介f虫op绩er狠at怠io扇n嘱co阳nd团it某io揭n第四谎节利液相杂制备掩色谱Pr谋ep萍ar菠at咱iv誉e筑li奖qu膨id呀c院hr姑om鲜at疮og据ra歪ph愉y第五匙节稠毛细另管电咳泳Ca镇pi星ll胆ar甩y衬el利ec第tr动op垦ho杏re忽si糊s,佩C蚊E20络23沟/6胶/2乖6第三匠章骨高效产液相持色谱姜法一、卷概述ge撑ne婆ra消li洞za任ti邮on二、奏基本织原理Ba孝si脉c应pr殃in裳ci徐pl肉e三、串毛细稀管电袭泳仪ap磨pl宏ic拘at形io览n累of避H谱PL健C四、系分离辉模式Se近pa零ra旦ti榆on败t和yp伤es治o投f元CE第五格节塔毛细椒管电吓泳hi找gh用p疑er厕fo浑rm架an偶ce乓l将iq蜡ui朴d盾ch田ro慎ma痒to艇gr宿ap罗hy慌(H激PL积C)Ca诉pi报ll留ar薄y湿el触ec摆tr听op菜ho滨re卖si废s,言C劣E20搂23岔/6张/2稳6一、榨概述ge洞ne作ra蹦li炕za亏ti磨on19迹37垄年，Ti短se贩li福us（瑞作典）守将蛋昼白质不混合应液放疤在两武段缓林冲溶第液之弓间，境两端汇施加钉电压伏，第献一次孟将人朱血清衰提取畅的蛋灰白质材混合四液分袋离出结白蛋套白和α、各β、省γ球蛋驳白。试样身的迁移方向和速父率由其电痒荷和喝淌度馅决定翼。第一坟次的自仿由溶昨液电恶泳；第一炮台电尤泳仪。肃获1像94抬8年诺贝生尔化龄学奖。20扮23呈/6暖/2军6经典涌电泳哑分析仗，操哀作烦亚琐，两分离翁效率荡低，回定量遮困难首，无牵法与袭其他刮分析匹方法裁相比离。19舒81渔年，Jo煮rg艳en趟so亩n和Lu剖ck敞as熊，用7访5m内径厦石英两毛细闪管进疾行电碰泳分植析，旁柱效贩高达铅40纪万/m，促进汪电泳盆技术锹发生国了根宇本变挽革，波迅速算发展拌成为斗可与GC，HP躲LC相媲驰美的械崭新蛮的分贤离分聪析技芦术——高效绿毛细房诚管电暗泳。20瓶23区/6型/2举6（1）双侨电层与电徒渗流在pH＞3的溶课液中婶，毛开细管驴内壁那与溶终液间师出现输双电欣层。蚕管内百壁带兵负电男荷，李柱内谎溶液图表面和带正叹电荷羡。电场搂作用冠下，帖毛细毛管柱游中出亮现：电泳惧现象缎和电炮渗流持现象(el重ec克tr沉oo膨sm替ot卵ic补f包lo渴w，协EO塘F)饿。电渗导流现滨象：柱内掏溶液底整体扯向负权极移辩动。二、项毛细永管电勇泳基移本原烫理20脂23网/6挖/2凉6（2）分册离过避程带电苗粒子炎的迁移任速率是=遵电绢泳傻+帝电渗塞流，两证种速态度的矢量唱和。（动闭画）20董23幸/6透/2辩6正离套子：两远种效闲应的掩方向盏一致芦，在负极求流出。中性粒子胳：无电泳些现象物，受弃电渗境流影耍响，屡在阳离川子之液后流蛛出；阴离姻子：两色种效树应的枝运动喷方向骡相反注。v电渗壶流<v电泳时，愿在阳极淡流出。v电渗闪流>v电泳时，餐阴离额子随贪电渗密流在负极会流出，在这离种情译况下伐，不顺但可裕以按俗种类仪分离统带电疫粒子寇，同域类离壳子由县于受珍到的芳电场鉴力不衣一样河也被戴分离算。20堤23斩/6协/2梯61.迁移炭速率恩：μep：电泳贷淌度抵，μep：电渗直淌度辆，单牢位：cm2·V-1·s-1；E：电预场强屯度；V：电竭压；L：毛细傅管总宗长度。（3）基本碎关系杀式淌度μ：单芦位时文间和委单位践场强毫下移旷动的旱距离鱼。其阅大小扁与粒分子的层净电烦荷、感半径盟及介尼质黏情度有滋关。20棍23协/6叮/2佳6当毛脾细管肌长度盖一定桨时，洪带电终离子岭的迁仍移速讨度与辣溶质赏离子糕的电旅荷、梦施加饲的电煤压、弊缓冲意液黏荒度及会带电缎离子蓄的大芝小有屋关。电渗论流的尼速率楚约等甲于一倡般离焦子电离泳速步率的滨5～冈7倍纳；各种似电性备离子倾在毛冬细管勉柱中墨的迁争移速垒度为龄：v+=ve+veo阳离牙子运动密方向梁与电波渗流一致；v-=veo-ve阴离仪子运动歼方向归与电渗流一致；v0=veo中性粒子讨运动谨方向陵与电些渗流一致。20天23饭/6庭/2渡62.迁移良时间（保工留时法间）CE兼具侍有电码化学走的特满性和继色谱杀分析根的特边性。V—外加身电压猾；L—毛细熊管总仙长度烤；l宰—毛细简管有伏效长娃度；=ep+铺eo。20井23臭/6抛/2饱63.分离侍效率症（塔哲板数跃）在CE中，肆仅存诉在纵袖向扩由散。从上判式可充以看雷出，提高巨分离赴电压是增拉加分休离效凯率的址主要聚途径昏。扩散烟系数箭小的句溶质僻比扩犬散系泊数大谦的分仅离效背率高，分跑离生参物大捎分子途（扩仗散系驴数小惯）的玩依据条。20煮23食/6视/2费64.分离喷度影响古分离辨度的销主要鼓因素:工作锄电压V；有效河淌度不差。提高裳毛细客管电唤泳的吹分辨读率有亚两条静途径趋：一汇是通臭过增冒大分虾离电嘉压来腿提高犯柱效由；二脾是控免制电椅渗流健。20榴23荒/6稳/2辩6主要致由高弱压电脸源、膜缓冲嘉液池滚、毛本细管求柱、炎检测双器及斗数据番处理馋等五照部分里组成陕。三、液高效川毛细航管电贸泳仪1.结构寄流程20猾23冒/6砌/2算62.主要部件（1）羽高压垂电源（1绢）0诉～30kV稳定伪、连钻续可计调的景直流输电源炮；（2得）具截有恒垫压、命恒流抄、恒宗功率护输出脆；（3爪）电趋场强笔度程况序控提制系赖统；（4猾）电醋压稳恋定性奥：0答.1予%；（5跃）电麻源极盾性易旬转换榜。20坝23餐/6浪/2委6（1在）材烘料：塑石英榜，各筋项性旦能好少；玻金璃，棉光学戴、机发械性醋能差道。（2锈）规心格：舅内径放20韵～7息5μm，外径轧35书0～养40歪0μm；长度姥≤1m。（2放）泊毛细切管柱20援23类/6蛾/2慰6（3惯）缓挤冲液很池（4清）检锄测器要求寻：具改有极匀高灵菜敏度睛，可晒柱端麻检测舟；化学哨惰性夹，机零械稳判定性吹好。20秒23型/6请/2阶6四、槐分离锣模式Se缎pa亡ra马ti泻on秆t屡yp添es浪o肌f岂CE八种姿分离承类型容，根麻据试像样性插质不段同，秩采用辅不同篮的分讨离类摘型；疑每种抛机理瞎的选直择性闻不同锦。1.毛细却管区首带电老泳ca晃pi源ll脊ar捕yzo染ne膛e扁le恋ct格ro则ph持or终es念is贿，肤CZ格E最基租本、性应用凡最广长的分须离模辱式20辉23霉/6轧/2建62串.毛细龄管凝挥胶电首泳Ca狡pi让ll右ar微y徒ge天l踢el禽ec画tr剩op赖ho等re茂si疯s镰，C掘GE将聚丙祖烯酰踪蝶胺或海琼脂钓等在毛贪细管误柱内啦交联桥生成袋凝胶编。其滤具有恋多孔而性，购试样葬分子按体竿积（陡分子盲量）调大小者分离迫的区难带电皇泳技坐术。蛋白闭质、DN沾A等的蹲荷/蓬质比遣与分玻子大施小无捆关，CZ砖E模式指很难习分离宴，采先用CG打E能获规得良盘好分楼离。无胶律筛分墙技术：采燥用低挪黏度殃的线湖性聚斯合物购溶液西代替悦高黏叛度交健联聚笔丙烯售酰胺舌。柱凤便宜没，易或制备寒。20叙23茅/6犹/2齿61.缓冲雷溶液中加抬入离厘子型拘表面蜓活性曾剂，肃其浓昼度达论到临批界浓凑度，聚彻集成艰一疏踏水内楚核，外部绪带负案电的球差形胶鲜束。3.胶束扇电动松毛细蚁管色色谱（ME哀CC忘，后ME巨KC蒜）mi露ce么ll蛛ar纽奉e还le庸ct板ro啊ki粒ne筑ti降c姑ca括pi四ll顽ar度y宫ch提ro鞠ma姑to挑gr咐ap躲hy在电资场力巩的作泡用下桐，胶抬束在倚柱中冶缓慢艳移动责（准固靠定相）。20颜23漠/6边/2尼62