高效液相色谱法操作规程

PAGEPAGE1高效液相色谱法操作规程第一篇：高效液相色谱法操作规程高效液相色谱法操作规程1．目的：规范高效液相色谱法检验操作。2．范围：适用于本公司中药材用高效液相法的检验。3．责任：检验室主任和相关检验员对本操作规程的实施负责。4．内容：4.1标准名称高效液相色谱法{中华人民共和国药典（20XX年版一部）附录VID}。4.2对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。离子交换填充剂，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂，用于分子排阻色谱等。除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20XX内记录完毕。4.3系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。4.3.1色谱柱的理论板数（n）在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半峰高宽（Wh/2），按n=5.54（tR/Wh/2）2计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。4.3.2分离度定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为：R=2(tR2tR1)W1W2式中：tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1及W2为此相邻两峰的峰宽。除另有规定外，分离度应大于1.5。4.3.3重复性取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120XX对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。4.4.4拖尾因子为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子（T）是否符合各品种项下的规定，或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：T=W0.05h2d1式中：W0.05h为0.05峰高处的峰宽；d1为峰极大至峰前沿之间的距离。除另有规定外，T应在0.95—1.05之间。4.4测定法定量测定时，可根据供试品的具体情况采用峰面积法或峰高法。测定杂质含量时，须采用峰面积法。4.4.1内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：校正因子（f）=AS/CSAR/CR式中：AS——为内标物质的峰面积或峰高；AR——为对照品的峰面积或峰高；CS——为内标物质的浓度；CR——为对照品的浓度。再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：含量（CX）=f·AXAS/CS式中：AX为供试品（或其杂质）峰面积或峰高；CX为供试品（或其杂质）的浓度。f、AS和CS的意义同上。当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液使用同一份内标物质溶液时，则配制内标物质溶液不必精密称（量）取。4.4.2外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（峰高），按下式计算含量：AXAR式中各符号意义同上。含量（CX）=CR4.4.3加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述（1）法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种正文中，用于校正杂质的实测峰面积。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节仪器灵敏度（以噪音水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰高约达满量程的10%—25%或其峰面积能准确积分（面积约为通常条件下满量程峰积分值的10%），然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间除另有规定外，应为主成分保留时间的若干倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。4.4.4不加校正因子的主成分自身对照法当没有杂质对照品时，可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述（3）法配制对照溶液并调节仪器灵敏度后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，前者的记录时间除另有规定外，应为主成分保留时间的若干倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ，再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。4.4.5面积归一化法由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。方法是测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率，即得。由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量环进样为好。第二篇：PMP柱前衍生高效液相色谱法的机理PMP柱前衍生高效液相色谱法的机理，以PMP与葡萄糖的反应为例：经PMP衍生化的单糖，在250nm有强烈的吸收，且衍生化产物结构稳定，不易分解，分析时其他杂质干扰小。第三篇：气相及液相色谱法基础知识气相色谱法基础知识一、气相色谱的简要介绍气相色谱法是二十世纪五十年代出现的一项重大科学技术成就。这是一种新的分离、分析技术，它在工业、农业、国防、建设、科学研究中都得到了广泛应用。气相色谱可分为气固色谱和气液色谱。气固色谱的“气”字指流动相是气体，“固”字指固定相是固体物质。例如活性炭、硅胶等。气液色谱的“气”字指流动相是气体，“液”字指固定相是液体。例如在惰性材料硅藻土涂上一层角鲨烷，可以分离、测定纯乙烯中的微量甲烷、乙炔、丙烯、丙烷等杂质。二、气相色谱法的特点气相色谱法是指用气体作为流动相的色谱法。由于样品在气相中传递速度快，因此样品组分在流动相和固定相之间可以瞬间地达到平衡。另外加上可选作固定相的物质很多，因此气相色谱法是一个分析速度快和分离效率高的分离分析方法。近年来采用高灵敏选择性检测器，使得它又具有分析灵敏度高、应用范围广等优点。三、气相色谱法的应用在石油化学工业中大部分的原料和产品都可采用气相色谱法来分析；在电力部门中可用来检查变压器的潜伏性故障；在环境保护工作中可用来监测城市大气和水的质量；在农业上可用来监测农作物中残留的农药；在商业部门可和来检验及鉴定食品质量的好坏；在医学上可用来研究人体新陈代谢、生理机能；在临床上用于鉴别药物中毒或疾病类型；在宇宙舴中可用来自动监测飞船密封仓内的气体等等。气相色谱专业知识气相色谱气相色谱是一种以气体为流动相的柱色谱法，根据所用固定相状态的不同可分为气-固色谱(GSC)和气-液色谱(GLC)。气相色谱原理气相色谱的流动相为惰性气体，气-固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。气相色谱流程载气由高压钢瓶中流出，经减压阀降压到所需压力后，通过净化干燥管使载气净化，再经稳压阀和转子流量计后，以稳定的压力、恒定的速度流经气化室与气化的样品混合，将样品气体带入色谱柱中进行分离。分离后的各组分随着载气先后流入检测器，然后载气放空。检测器将物质的浓度或质量的变化转变为一定的电信号，经放大后在记录仪上记录下来，就得到色谱流出曲线。根据色谱流出曲线上得到的每个峰的保留时间，可以进行定性分析，根据峰面积或峰高的大小，可以进行定量分析。气相色谱仪由以下五大系统组成：气路系统、进样系统、分离系统、温控系统、检测记录系统。组分能否分开，关键在于色谱柱；分离后组分能否鉴定出来则在于检测器，所以分离系统和检测系统是仪器的核心。气相色谱仪液相色谱法液相色谱法气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。液相色谱法就是用液体作为流动相的色谱法。1903年俄国化学家M.C.茨维特首先将液相色谱法用于分离叶绿素。原理和分类液相色谱法的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱和以微硅胶为基质的键合相色谱。根据固定相的形式，液相色谱法可以分为柱色谱法、纸色谱法及薄层色谱法。按吸附力可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱。近年来，在液相柱色谱系统中加上高压液流系统，使流动相在高压下快速流动，以提高分离效果，因此出现了高效（又称高压）液相色谱法。①液固吸附色谱。高效液相色谱中的一种，是基于物质吸附作用的不同而实现分离。其固定相是一些具有吸附活性的物质如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。②液液分配色谱法。基于被测物质在固定相和流动相之间的相对溶解度的差异，通过溶质在两相之间进行分配以实现分离。根据固定相与流动相的极性不同，分为正相色谱和反相色谱。前者是用硅胶或极性键合相为固定相，非极性溶剂为流动相；后者是硅胶为基质的烷基键合相为固定相，极性溶剂为流动相，适用于非极性化合物的分离。③离子交换色谱法。基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对离子交换基具有不同的亲和力而实现分离。薄壳型离子交换树脂柱效高，主要用来分离简单的混合物；多孔性树脂进样容量大，主要用来分离复杂混合物。④凝胶渗透色谱法[1]。又称为尺寸排阻色谱法。1959年首先用于生物化学领域。以溶剂为流动相，多孔填料（如多孔硅胶、多孔玻璃）或多孔交联高分子凝胶为分离介质的液相色谱法。当混合物溶液入凝胶色谱柱后，流经多孔凝胶时，体积比多孔凝胶孔隙大的分子不能渗透到凝胶孔隙里去而从凝胶颗粒间隙中流过，较早地被冲洗出柱外，而小分子可渗透到凝胶孔隙里面去，较晚地被冲洗出来，混合物经过凝胶色谱柱后就按其分子大小顺序先后由柱中流出达到分离的目的。用凝胶渗透色谱的优点是：分离不需要梯度冲洗装置；同样大小的柱能接受比通常液相色谱大得多的试样量；试样在柱中稀释少，因而容易检测；组分的保留时间可提供分子尺寸信息；色谱柱寿命长。它的缺点是：不能分离分子尺寸相同的混合物，色谱柱的分离度低；峰容量小；可能有其他保留机理起作用时引起干扰。凝胶渗透色谱法为测定高聚物分子量和分子量分布提供了一个有效的方法，此外还可用来分离齐聚物、单体和聚合物添加剂等。⑤离子色谱法。采用柱色谱技术的一种高效液相色谱法，样品展开方式采用洗脱法。根据不同的分离方式，离子色谱可以分为高效离子色谱、离子排斥色谱和流动相离子色谱3类。高效离子色谱法使用低容量的离子交换树脂，分离机理主要是离子交换。离子排斥色谱法用高容量的树脂，分离机理主要是利用离子排斥原理。流动相离子色谱用不含离子交换基团的多孔树脂，分离机理主要是基于吸附和离子对的形成。离子色谱仪由淋洗液贮存器、泵、进样阀、分离柱、抑制柱、电导检导器和数据处理单元等组成。离子色谱仪最重要的部件是分离柱，装有离子交换树脂。抑制柱是抑制型离子色谱仪的关键部件，其作用是将淋洗液转变成低电导部分，以降低来自淋洗液的背景电导，同时将样品离子转变成其相应的酸或碱，以增加其电导。分离阴离子，抑制柱填充强酸性阳离子交换树脂；分离阳离子，抑制柱填充强碱性阴离子交换树脂。检测器分通用型检测器与专用型检测器。前者如电导检测器，对检测池中所有离子都有响应；后者如紫外-可见分光光度计，对离子具有选择性响应。离子色谱法具有快速、灵敏、选择性好和同时测定多组分的优点。尤其对于阴离子的测定，离子色谱的出现是分析化学中的一项突破性的新进展。离子色谱法主要用于测定各种离子含量，广泛应用于水、纸浆和漂白液、食品分析、生物体液、钢铁和环境分析等各个领域。设备高效液相色谱仪由输出泵、进样装置、色谱柱、梯度冲洗装置、检测器及数据处理和微机控制单元组成。输出泵的功能是将冲洗剂在高压下连续不断地送入柱系统，使混合物试样在色谱中完成分离过程。常用的进样方式有3种：注射器隔膜进样、阀进样和自动进样器进样。色谱柱的功能是将混合物中各组分分离。梯度冲洗又称溶剂程序，通过连续改变冲洗剂的组成，改善复杂样品的分离度，缩短分析周期和改善峰形，其功能类似于气相色谱中的程序升温。检测器的功能是将从色谱柱中流出的已经分离的组分显示出来或转换为相应的电信号，主要有紫外吸收检测器、荧光检测器、电化学检测器和折光示差检测器，其中以紫外吸收检测器使用最广。现代化的仪器都配有计算机，以实现自动处理数据、绘图和打印分析报告第四篇：牛奶中阿维菌素类药物残留检测——高效液相色谱法(SOP)修改版-新牛奶中阿维菌素类药物残留检测—高效液相色谱法安全要求该检验的提取、净化步骤应在通风橱中进行，操作中需着工作服、戴口罩手套，避免溶剂气体吸入和皮肤接触；废弃的化学试剂收集到专用容器集中处理。急救措施皮肤触到有机溶剂或酸,用清水清洗，溅入眼中用纯水灌洗。适用范围该操作规程适用于牛奶中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素残留量的制样及测定。职责进行该项检验的检验员必须按该操作规程进行检验，质量监督员负责监督该操作规程的正确执行。检测原理用乙腈提取试料中残留的阿维菌素类药物，加水稀释，加三乙胺使溶液呈弱碱性，C18固相萃取柱净化，加三氟乙酸酐和N-甲基咪唑衍生化。高效液相色谱-荧光检测法测定，外标法定量。方法灵敏度本方法在牛奶中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的检测限均为1µg/kg，定量限均为2µg/kg。注意事项7.1整个净化步骤控制C18柱流速约在1～2mL/min；7.2C18柱使用过程中除特别说明外，应避免柱床干涸。材料、仪器、试剂的准备及基本要求除特别注明外，以下所用试剂均为分析纯；水为超纯水。8.1阿维菌素标准品含量≥95.7%8.2多拉菌素标准品含量≥92.6%8.3伊维菌素标准品含量≥93.9%8.4乙腈色谱纯8.5甲醇色谱纯8.6三氟乙酸酐8.7三乙胺8.8异辛烷8.9N-甲基咪唑8.10C18固相萃取柱500mg/6cc，或相当者8.11固相萃取柱洗涤液；取乙腈30mL、水70mL和三乙胺20XXL，混匀。8.12衍生化试剂a)A液：N-甲基咪唑-乙腈（1+1，v/v）。现用现配。b)B液：三氟乙酸酐-乙腈（1+2，v/v）。现用现配。8.131mg/mL阿维菌素类药物混合标准贮备液：分别称取阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素标准品10mg，精密称定，于10mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度。配制成阿维菌素类药物浓度为1mg/mL的混合标准贮备液，-20XX存，有效期6个月。8.1410µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液：准确量取混合标准贮备液0.25mL，于25mL量瓶中,用乙腈稀释并配制成阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素浓度为10µg/mL标准工作液。-20XX保存，有效期1个月。8.151µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液：准确量取10µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液2.5mL，于25mL量瓶中,用乙腈稀释配制成阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素浓度为1µg/mL标准工作液。-20XX保存，有效期1个月。8.16高效液相色谱仪（配荧光检测器）8.17分析天平感量0.00001g8.18天平感量0.01g8.19振荡器8.20XX心机8.21涡旋混合仪8.22聚丙烯离心管mL8.23氮吹仪8.24C18固相萃取柱500mg/6cc，或相当者8.25微孔滤膜0.45µm检验步骤9.1试料的制备9.1.1取混匀后的供试样品，作为供试试料。9.1.2取混匀后的空白样品，作为空白试料（阴性对照）。9.1.3取混匀后的空白样品5g,添加1µg/mL的工作液0.05mL，作为空白添加试料。9.2标准曲线的制备精密量取1µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.02、0.05、0.1mL，于10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度；精密量取10µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.25mL，于50mL量瓶中，0.1、0.3mL至10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，配制成浓度分别为2、5、10、50、100、300ng/mL的阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素混合标准溶液，各取1.0mL于各自的10mL试管中，于50℃水浴氮气吹干，按衍生化步骤处理后，将系列标准溶液，供高效液相色谱测定，从低浓度到高浓度依次测定，每一浓度进样3针。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。9.3提取9.2.1称取(5±0.05)g试料，于50mL离心管中，加乙腈8mL，涡旋混匀，中速振荡5min，5000r/min离心10min。9.2.2收集上清液于另一50mL离心管中。残渣再重复提取一次。9.2.3合并两次上清液，加水15mL和三乙胺50µl，混匀，备用。9.4净化9.4.1依次用乙腈5mL、固相萃取柱洗涤液5mL，活化C18固相萃取柱。9.4.2将备用液过柱，抽干。加异辛烷3mL洗涤，抽干。9.4.3用乙腈5mL洗脱。收集洗脱液于10mL试管中，50℃下用氮气吹干。备用9.5衍生化向试管中依次加入衍生化试剂A液100µL和衍生化试剂B液150µL，密闭，涡动10s，依次加冰醋酸、三乙胺各50µL，涡动10s，密闭反应30min，加650µL甲醇混匀。经0.45µm微孔滤膜过滤，供高效液相色谱检测。9.6测定9.6.1色谱条件9.6.1.1色谱柱：C18柱，（250×4.6mm，粒径5µm）；或相当者；9.6.1.2流动相：乙腈+水（90+10，v/v）；9.6.1.3流速：1.8mL/min；9.6.1.4检测波长：激发波长：365nm，发射波长：475nm；9.6.1.5柱温：40℃；9.6.1.6进样量：20XXL。9.7测定法9.7.1试样溶液和50ng/mL的标准溶液，作单点校准，以峰面积计算。标准溶液及试样溶液中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内，试样溶液测定过程中应参插注入标准溶液，以便准确定量。空白、添加、标准溶液高效液相色谱图见附录及附加说明。9.7.2试剂空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。9.8结果计算和表述试料中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的残留量（μg/kg），按下式计算：X=式中:X——试料中相应的阿维菌素类药物的残留量，μg/kg；C——试样溶液中相应的阿维菌素类药物的浓度，ng/mL；V——衍生化后试样的总体积，mL；m——供试试料的质量，g。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9.9结果判定CVm9.9.1线性范围阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素在2～300ng/mL范围考察线性，计算回归方程，其相关系数应≥0.995。9.9.2准确度本方法在2～50μg/kg添加浓度的回收率为70～120XX。9.9.3精密度本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20XX9.9.4判定当方法学考察结果符合上述规定时，供试组织中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的残留量单个及之和Xi＜检测限时，判定为未检出；方法检测限≤Xi＜最高残留限量时,判i1i1nn定为符合规定；Xi1ni≥最高残留限量时，判定为不符合规定。注：仅当Xi≥方法检测限时，Xi为参与阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素总残留量求和计算，故求和公式中0≤n≤3。9.10附录及附加说明阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素在牛奶中的最