土霉素生产工艺实训实验报告

土霉素生产工艺(实训实验报告姓 名:班 级：生物学 号:指导教师：目录TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"第一章绪论 2\o"CurrentDocument"土霉素的简介 2\o"CurrentDocument"1.2实验的目的、要求与过程 2\o"CurrentDocument"第二章设备型号 4\o"CurrentDocument"第三章操作步骤 5\o"CurrentDocument"3.1斜面孢子的制备 5\o"CurrentDocument"3.2种子培养基的制备与灭菌 5\o"CurrentDocument"3.3发酵培养基的配制与灭菌 6\o"CurrentDocument"3.4发酵 6\o"CurrentDocument"3.5测定前发酵样品预处理 6\o"CurrentDocument"土霉素酸化液的发酵提取 6\o"CurrentDocument"原理 73.6.2酸化提取方法 7\o"CurrentDocument"122#树脂预处理方法 7\o"CurrentDocument"3.8结品与干燥 83.9相关数据的测定 9pH的测定 93.9.2发酵液效价的测定 9\o"CurrentDocument"3.10标准曲线的绘制 10\o"CurrentDocument"第四章讨论 11参考文献 12第一章绪论1.1土霉素的简介土霉素是四环类抗生素，其在结构上含有四并苯的基本母核，随环上取代基的不同或位置的不同而构成不同种类的四环素类抗生素。其结构和命名如图。土霉素是由龟裂链丝菌(S.rimosus)产生的，属于放线菌中的链霉菌属，他们具有发育零号的菌丝体，菌丝体分枝捂隔膜，直径约为0.4〜1.0米，长短不一，多核。菌丝体有营养菌丝、气生菌丝和孢子丝之分，孢子丝分化成为分生孢子，而龟裂链丝菌的菌落为灰白色，后期生褶皱，成龟裂状。土霉素是典型的次级代谢产物，其发酵的特点之一就是分批过程分为菌体的生长期、产物期和菌体期三个阶段。龟裂链丝菌的生长和土霉素的生物合成受到许多发酵条件的影响：温度、发酵PH值、溶氧、接种量、泡沫等。同时还受到一些代谢调控机制的控制，磷酸盐的调节作用、ATP的调节和产生菌生长速率的调节等。1.2实验的目的、要求与过程通过专业综合训练我们了解了一种生物产品从上游的菌种培养、发酵工段到下游的提取纯化等工段的完整的生产过程。让学生们理论联系实际，实训过程中锻炼了学生的动手与思考能力，在实践操作中发现问题并利用自己的专业知识解决问题。同时让学生对土霉素这一生产过程有了充分的认识，为后续的课程设计以及毕业设计打下了良好的基础，减少不必要的错误，使实验更加完善。实训要求我们掌握土霉素生产的工艺流程，掌握分批发酵的原理，熟悉发酵罐的灭菌与使用方法；观察并记录上罐发酵过程中菌体的生长变化；掌握土霉素提取结品等工艺的原理及操作步骤；掌握土霉素效价的测定原理及方法。实训按照土霉素的生产工艺流程进行，首先进行培养基的配制及灭菌，然后菌种培养并开始发酵，最后对发酵液处理以及测定产品的效价。由于实训时间要进行一周左右，并且实验设备有限，所以我们分组进行实验，彼此间分工合作，相互协调。发酵过程中需要在一定时间内进行OD值的测定以及观察发酵罐的工作情况，我们小组每个人都积极参与，以保证实训顺利地完成。第二章设备型号主要使用的设备型号编号单位空气怛温振荡器电子天平可见分光光度计HZQ-CMP2002上海精密科学仪器有限公司发酵罐0303BICF-200220051829空气压缩机储气罐静音式全无忧空压机CW120CF0407303台州市寓芳压缩机公司鞍山佳朋压缩机有限公司离心机树脂柱LG10-2.4A北京医用离心机厂上海亚荣生化仪器厂电热复空干燥箱自动压力蒸汽灭菌机磁力搅拌器2K-82BBGI54DWJB-120041041上海实验仪器有限公司第三章操作步骤3.1斜面孢子的制备无菌条件下，从冷藏的龟裂链丝菌（S.rimosus）的斜面孢子中，刮取适量孢子涂在PD（马铃薯培养基）斜面上，然后置30°C的恒温培养3天。我们采用马铃薯葡萄糖（PD）培养基制作固体试管斜面，它是一种常用培养基，其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试验，每试管约5-10ml（视试管大小而定）马铃薯葡萄糖琼脂（PD）培养基配方表成分含量马铃薯水葡萄糖200g1000ml10-20gPD培养基的灭菌条件：在高压蒸汽灭菌锅内保持121C,0.14MPa下，20分钟即可。种子斜面：无菌条件下，从冷藏的产生菌的斜面孢子中刮取适量孢子涂在试管斜面上，然后置28-30C的恒温箱培养3天。传代两次，每次接种前挑选长势较好的孢子进行后面的接种，就可以得到较为强壮、优秀的孢子。3.2种子培养基的制备与灭菌种子培养基配方表成分含量淀粉3%黄豆饼粉0.3%硫酸铵0.4%碳酸钙0.5%玉米浆0.4%氯化钠0.5%磷酸二氢钾0.015%按成分配比配制培养基，并加淀粉酶液化后，（就是在白磁板上滴加稀碘液后在加入一定量的培养基液体，待其不变成紫色，这时液化完全）再加入CaCO3,冷却后调pH值7.0-7.2，分装，包装灭菌。灭菌条件：在高压蒸汽灭菌锅内保持121^,0.14Mpa下，20分钟即可。3.3发酵培养基的配制与灭菌发酵培养基配方表成分配比淀粉15%黄豆饼粉2%硫酸铵1.4%碳酸钙1.4%氯化钠0.4%玉米浆0.4%磷酸二氢钾0.01%氯化钻10pg/ml淀粉酶0.1%—0.2%按发酵培养基成分配比，配制培养J基，并加淀粉酶液化后，（在白磁板上滴加稀碘液后在加入一定量的培养基液体，待其不变成紫色，这时液化完全）再加入CaCO3，冷却后调pH值7.0—7.2,分装，包装灭菌。灭菌条件：在高压蒸汽灭菌锅内保持121^，0.14Mpa下，20分钟即可。3.4发酵发酵液2.5升装入发酵罐，离座灭菌。接入电源，将已灭菌的发酵培养基通入无菌空气，调整好发酵罐的各类初始参数：温度为30°C、pH6.5、搅拌100r/min、泡沫和消泡剂（豆油）自动调节等。12小时后观察是否生长杂菌，再将无水乙醇倒入接种口的环槽内，点燃后，进行无菌接种操作，接种量一般为10%。通气量为1:0.5〜1.0vvm，全程用消泡剂消泡，发酵过程通氨，当接种后发酵pH低于6.5时就可以开始通氨，通氨量的多少参考pH值。要求73小时前pH在6.3〜6.6,72〜120小时pH在6.2〜6.4,120〜140小时pH在6.0〜6.2。土霉素的发酵周期约7天，每隔24小时测一次龟裂链丝菌的菌丝浓度，采用721分光光度计在620nm下测发酵液OD值，同时测定土霉素效价。在菌丝接近自溶期前放罐，得到土霉素发酵液。3.5测定前发酵样品预处理发酵瓶摇匀，将少量倒入小烧杯，测pH。用9mol/L的盐酸溶液酸化pH至1.7〜2.0搅拌10分钟，取5ml酸化液至7ml离心管，6000转离心4分钟，取上清液，备测。3.6土霉素酸化液的发酵提取3.6.1原理土霉素在发酵过程中，所产生的土霉素积聚在菌丝中的浓度并不高。因此，对于土霉素发酵液进行处理的主要目的就是让土霉素从菌丝中释放出来，有利于发酵液中，有利于从发酵液中提取土霉素，更能提高土霉素的收率和质量。土霉素发酵液中预处理首先要进行的操作是酸化，一般用草酸进行酸化。加入草酸的目的是释放菌丝中的土霉素，同时要保证土霉素的稳定性、成品的质量和提炼成本。另外，草酸属于弱酸，其对设备的腐蚀性要比盐酸、硫酸小。采用草酸不仅能使土霉素释放出来并生成溶于水的盐，并且能析出草酸钙沉淀，从而去除发酵液中的钙离子，同时草酸钙能促进蛋白质的凝结，从而提高滤液的质量。目前，工业提炼的pH值控制在1.6〜2.0范围内，pH值过高对单位的释放不利，pH值过低会影响产品的质量，同时会增加产品的成本。去杂过程采用的净化剂是黄血盐和硫酸锌，前者有利于提取出铁离子，后者有利于凝固蛋白质。此外，两者的协同可以产生复盐，对蛋白质有效应除去蛋白质，同时除去铁离子。3.6.2酸化提取方法取200ml发酵液，边搅拌，边加入黄血盐、硫酸锌，并加入草酸酸化发酵液，草酸的量通过用酸度计测其pH值来确定，调到所需pH=1.75后，搅拌30分钟。（黄血盐的加入量约为酸化前发酵液的0.35%）酸化后要将酸化液进行适当的稀释，一般稀释2-3倍，有利于过滤脱色过程（本实验中为两倍）。本实验中由于酸化液的粘度较大，用简单的过滤方法无法得到效果较好的固液分离，所以采用离心（6000r/min、5min）方法实现固液分离，取其上清液（129ml）。3.7122#树脂预处理方法122#树脂系弱酸性阳离子酚醛缩聚型，把122#树脂生产的质量提高到应有的水平，以交换树脂。自1965年试制成功并投产以来，在便适应抗生素生产发展之需。链霉素脱色，土霉素脱色，四环素脱色以及维生素q。提取方面广为应用，并已在全国推广。⑴将准备装柱使用的新树脂，先用热水（清洁的自来水即可）反复清洗，阳离子交换树脂可用70-80°C的热水。开始浸洗时，每隔约15分钟换水一次，浸洗时不要搅动，换水4-5次后，可隔约30分钟换水一次，总换水7-8次，浸洗至浸洗水不带褐色，泡沫很少时为止。水洗后，再经酸碱处理，阳离子交换树脂可按下述步骤处理：用1N盐酸浸泡树脂，盐酸用量为树脂自身体积的3-5倍，浸泡2-3.5小时。用自来水冲洗全出水pH为5左右，用3倍树脂体积5%的NaCl溶液浸泡2小时。用1N氢氧化钠浸泡树脂，用量约为树脂本身体积的3-5倍，浸泡2-3.5小时。用水冲洗全出水pH为9左右。用1N盐酸浸泡树脂，用量约为树脂本身体积的3-5倍，浸泡2-3.5小时，将树脂转成H型。用酸浸泡完后用去离子水冲洗至出水pH为6以上即可投入使用。对于阴离子交换树脂水洗后的酸碱处理次序，可采用碱-酸-碱的次序。树脂预处理过程中，用碱浸泡树脂，颜色由本身向橘黄色变为棕黑色，再用酸浸泡，树脂颜色又由棕黑色变为橘黄色。将处理后的树脂填装入树脂柱，进行酸化液脱色，脱色时流速不能太大，以免造成脱色不充分。3.8结晶与干燥将一定量脱色液放入烧杯，用碱化剂调pH值到土霉素等电点附近(pH-4.76)。恒温28C-30C用磁力搅拌器搅拌结品，搅拌转数为70rpm。将一定量结品母液倒入培养皿放入ZK-82BB型电热真空干燥箱中进行干燥，干燥后测定干粉的质量，然后将十粉稀释10倍，测定其效价。目前生产工艺一般采用pH值4.5-4.7，此工艺去除蛋白比较彻底，可达到短结品时间内改善晶体粒度和提高结品收率的目的。在结品时间47min后试验所得湿品体与原工艺生产(pH值1.75-1.85，黄血盐钠2.49g/ml，硫酸锌1.59g/ml，结品温度30C，结品pH值4.6、结品时间47min)相比，在结品时间不变的前提下，品体存在明显差异，原工艺得到的品体粒度细小，分布宽泛，品型主要是针状和薄片状；新工艺得到晶体粒度粗壮、均一，品型主要是四棱柱状，试验证实其在制取高纯度土霉素过程中溶解度提高。新工艺因结品过程杂质干扰较小，pH值控制更接近土霉素等电点，所得结品母液低于原工艺，是提高结品收率的有效措施。⑵3.9相关数据的测定3.9.1pH的测定（1） 测样品不宜在室温下放置时间过长，应当在取样2分钟之内测定完，不能直接测定的样品应收样放入冰箱，如需测定时提前从冰箱中取出放全室温测定。（2） 打开酸度计，调节温度补偿旋钮全室温。（3） 用pH=6.86和pH=4.0的缓冲液校准pH计。（4） 校准后，纯净水冲洗电极，将电极放入被测样中，待读数稳定后读数。（5） 测定样品后应该用纯净水冲洗电极，不用时应将电极放置在饱和氯化钾溶液中。3.9.2发酵液效价的测定（1） 取样品加9mol/L的盐酸溶液，先酸化至pH=1.5-1.7,用酸度计测量，放置5分钟，过滤至5ml以上，吸取滤液稀释适宜倍数（使稀释后效价在标准曲线范围内），用移液管取1ml稀释液于试管中，准确加入0.01mol/L的盐酸，使全量为20ml，再加入0.05%g/ml的三氯化铁溶液10ml，使全量为20ml，摇匀，放置20分钟，另取1ml稀释液，加入0.01mol/L的盐酸19ml，使全量为20ml，摇匀，放置20分钟，作为空白，在480nm的波长下测两种液体的吸光度。（2） 提取过程中间样效价的测定：取中间样，稀释至适宜倍数（使稀释后效价在标准曲线范围内），以下操作同发酵液效价的测定方法。（3） 效价计算：将测定的吸光度值代入标准曲线方程，再乘以稀释倍数即得各步效价。（4） 在不同pH值和不同的黄血盐钠用量条件下进行了影响酸化液中土霉素效价因素的正交实验分析；测定酸化液中土霉素效价。通过实验得到以下结论：1.pH值是酸化工段中影响土霉素质量的主要因素，黄血盐钠的用量次之;2.本实验中最佳酸化条件为:pH值控制在1.43左右，黄血盐钠的用量控制在发酵液体积的0.35%时得到土霉素效价最高，为5102u/g;3经过酸化处理后，酸化液中土霉素的效价比发酵液中土霉素的效价最大提高了47.1%。[3]3.10标准曲线的绘制标准称取土碱标品25mg，置于三角瓶内，加0.1mol/L盐酸，4mol使之完全溶解，再用0.01mol/L盐酸按下列公式稀释成标准液，其中，w为土碱标准品称样量。0.01mol/L盐酸加入量(ml)=土霉素效价xw(mg)/500—ml精密量取标液0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.0ml，分别放入50ml三角瓶中，分别加入0.025%Fecl3溶液至总体积20ml，放入38±1°C水浴中，放置3min，冷却全室温测定吸收度，测定波长500nm，同时做空白试验，不加Fecl3溶液其他相同，总体积20ml。以吸收度为纵坐标，土霉素效价单位为横坐标，绘制曲线并计算回归方程及相关系数。Y为测吸收值，X为曲线中土霉素浓度，r应在0.9990-1.001之间。b=Zxy-nxy/zx2-nx2a=y-bxr=zxy-nxy/[(zx2-nx2)(zy2-ny2)]1/2第四章讨论尽管在实验过程中，我们小组的成员都非常积极主动地进行试验，然而遗憾的是我们的实验最终以失败告终。当我们在实验过程中发现发酵罐温度过高以及发酵液颜色变得越来越深时，没有进行及时的处理，任其发展，最终导致了发酵液糖化，并被大量蒸发，在测量OD值时出现了读数为负的现象。虽然最后发现发酵罐本身存在一些问题，但是究其缘