免疫细胞功能检测技术

免疫细胞功能(gōngnéng)检测技术第一页，共四十三页。整理课件一淋巴细胞的功能(gōngnéng)检测

淋巴细胞功能(gōngnéng)测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定第二页，共四十三页。整理课件淋巴细胞T细胞（负责细胞免疫功能）B细胞（执行(zhíxíng)体液免疫功能）NK细胞（非特异性免疫作用）第三页，共四十三页。整理课件一、T细胞(xìbāo)功能的检测T细胞增殖试验T细胞分泌(fēnmì)功能测定T细胞介导的细胞毒试验体内试验第四页，共四十三页。整理课件（一）T淋巴细胞增殖(zēngzhí)试验1.原理(yuánlǐ)：淋巴细胞DNA合成(héchéng)分化母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松第五页，共四十三页。整理课件

未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞过渡型细胞大小(直径μm)12～2012～166～8核大小、染色质增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4个有或无无有丝分裂有或无无无胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色浆内空泡有或无有或无无伪足有或无有或无无第六页，共四十三页。整理课件2.淋巴细胞转化(zhuǎnhuà)的刺激物非特异性刺激物：

PHA------T细胞

ConA-------T细胞

PWM-------T、B细胞

LPS-------B细胞特异性刺激物：异种抗原(kàngyuán)同种组织抗原

第七页，共四十三页。整理课件3.检测(jiǎncè)方法

形态法：刺激物淋巴细胞（4-6天）母细胞化同位素法：PHA淋巴细胞（54h）

DNA合成期+3HTdR掺入

收集细胞(xìbāo)

检测β射线

测定(cèdìng)细胞内的3H－TdR第八页，共四十三页。整理课件（1）形态学检查法第九页，共四十三页。整理课件方法学评价(píngjià)：优点：形态学方法(fāngfǎ)简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。第十页，共四十三页。整理课件培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性（2）3H-TdR掺入法第十一页，共四十三页。整理课件优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时(tóngshí)还存在放射性核素污染问题。第十二页，共四十三页。整理课件培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性MTT测吸光度(guāngdù)(3)MTT比色法第十三页，共四十三页。整理课件(二)T细胞分泌功能(gōngnéng)测定

体外培养(péiyǎng)的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。

第十四页，共四十三页。整理课件（三）T细胞(xìbāo)介导的细胞(xìbāo)毒试验1.原理(yuánlǐ)：靶细胞抗原(kàngyuán)T细胞观察杀伤活力致敏CTL靶细胞第十五页，共四十三页。整理课件形态学方法：淋巴细胞+肿瘤(zhǒngliú)细胞计数残留肿瘤(zhǒngliú)细胞2.方法(fāngfǎ)意义(yìyì)：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力

第十六页，共四十三页。整理课件图15-2T细胞细胞毒试验示意图第十七页，共四十三页。整理课件靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时51Cr释放(shìfàng)法第十八页，共四十三页。整理课件(四)体内(tǐnèi)试验特异性抗原(kàngyuán)皮肤试验PHA皮肤试验第十九页，共四十三页。整理课件二、B细胞(xìbāo)功能检测B细胞(xìbāo)增殖能力的试验溶血空斑试验B细胞抗体形成功能的检测体内试验第二十页，共四十三页。整理课件(一)B细胞(xìbāo)增殖能力的试验抗IgM细菌(xìjūn)脂多糖SAC的SPA

B细胞(xìbāo)增殖形态学3H－TdR掺入法第二十一页，共四十三页。整理课件(二)溶血(rónɡxuè)空斑试验1.原理(yuánlǐ)：第二十二页，共四十三页。整理课件2.方法学：经典溶血(rónɡxuè)空斑形成试验被动溶血空斑试验

第二十三页，共四十三页。整理课件3．临床应用(yìngyòng)与评价溶血(rónɡxuè)空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。

第二十四页，共四十三页。整理课件(三)

B细胞抗体(kàngtǐ)形成功能的检测

——酶联免疫斑点法ELISPOT1.原理(yuánlǐ)：第二十五页，共四十三页。整理课件2．应用(yìngyòng)与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导(yòudǎo)的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。第二十六页，共四十三页。整理课件(四)体内(tǐnèi)试验体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清(xuèqīng)，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。第二十七页，共四十三页。整理课件染色(rǎnsè)计数离心(líxīn)取上清测LDH或AKP离心(líxīn)取沉淀测活细胞荧光测发光强度测CPM值形态法酶释法荧光法同位素法化学发光法三、NK细胞活性测定靶细胞溶解常用靶细胞:

K562细胞株第二十八页，共四十三页。整理课件二吞噬细胞(tūnshìxìbāo)功能检测技术

按其形态大小分为(fēnwéi)两类：大吞噬细胞—单核-吞噬细胞系统小吞噬细胞—中性粒细胞第二十九页，共四十三页。整理课件一、中性(zhōngxìng)粒细胞功能的检测

细胞趋化功能的检测吞噬(tūnshì)和杀菌功能的检测第三十页，共四十三页。整理课件(一)细胞(xìbāo)运动功能——趋化功能检测1.原理(yuánlǐ)：第三十一页，共四十三页。整理课件2.方法(fāngfǎ)：

琼脂糖平板(píngbǎn)法

滤膜渗透法（Boyden小室法）第三十二页，共四十三页。整理课件(二)吞噬(tūnshì)和杀菌功能测定1．显微镜检查法：第三十三页，共四十三页。整理课件2.溶菌法第三十四页，共四十三页。整理课件NBT还原(huányuán)试验

原理(yuánlǐ)：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黄色）甲臜（紫黑色）3．NBT还原(huányuán)试验

第三十五页，共四十三页。整理课件中性(zhōngxìng)粒细胞NBT甲臜颗粒(kēlì)沉积于胞质中第三十六页，共四十三页。整理课件二、巨噬细胞功能(gōngnéng)检测(一)炭粒廓清(kuòqīng)试验

正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度(yìndù)墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。第三十七页，共四十三页。整理课件(二)吞噬(tūnshì)功能检测

巨噬细胞对颗粒性抗原物质(wùzhì)具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。第三十八页，共四十三页。整理课件(三)巨噬细胞溶酶体酶的测定(cèdìng)1．酸性磷酸酶的测定硝酸铅法偶氮法2．非特异性酯酶的测定常用(chánɡyònɡ)α-萘醋酸法第三十九页，共四十三页。整理课件(四)细胞毒作用(zuòyòng)测定

用IFN-γ激活小鼠巨噬细胞，观察其对125I-UdR标记(biāojì)的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815的杀伤活性。第四十页，共四十三页。整理课件(五)巨噬细胞促凝血活性测定(cèdìng)

激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固(nínggù)，为此取已经37℃预温的正常兔血浆和CaCl2混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置37℃，即时记录血浆凝固时间。第四十一页，共四十三页。整理课件Thanks！第四十二页，共四十三页。整理课件内容(nèiróng)总结免疫细胞