植物黄酮类物质基因工程

植物黄酮类物质基因工程应用研究进展摘要：黄酮类次生代谢产物基因工程是指通过基因工程的手段有目的地修饰个物种中某一代谢途径，或引入一新的代谢途径，以达到提高或降低黄酮类代谢产物的合成水平，或使被修饰物种产生某种新的次生代谢产物的操作。黄酮类次生代谢物的基因工程包括基因添加，基因剔除，基因的协同转化，调控因子等在代谢途径上的调控。关键字：黄酮类物质基因工程进展AbstractFlavonoidsecondarymetabolitesbygeneticengineering,geneticengineeringisameansofpurposefulmodificationofametabolicpathwayinaspecies,orintroduceanewmetabolicpathwaystoachievetheincreaseordecreasethesynthesisofflavonoidmetabolitelevels,ortosomenewspecieshavebeenmodifiedsecondarymetabolitesoperation.Secondarymetabolitesofflavonoids,includinggeneticengineering,geneadded,geneknockout,genecotransformation,andotherregulatoryfactorsontheregulationofthemetabolicpathways.Keywords:FlavonoidsAdvancesingeneticengineering.引言黄酮类物质，是一类在植物界广泛存在的低分子量的多酚类次生代谢产物，从苔藓植物到被子植物都含有这类物质。在自然界中，类黄酮与许多的功能都有关，类黄酮物质是花，果实和种子颜色的主要显色物质，能够保护植物抵御紫外线和防止病源微生物侵袭，能够提高农作物产量，调节植物生长素的运输，在植物和细菌的相互作用中作为信号分子，促进花粉萌发并且和花粉的育性直接相关。同时，黄酮类化合物是一类生物活性很强的化合物，是一种天然的抗氧化剂，具有降低心肌耗氧量、防治血管硬化等作用，具有抗衰老、增强机体免疫力、抗癌防癌的功效［1］。在医药、食品等领域具有广阔的应用前景。在植物次生代谢中，类黄酮的生物合成是目前研究最为深入的次生代谢途径。植物类黄酮生物合成途径主要由两类基因控制：结构基因和调节基因。其中，结构基因直接编码与类黄酮次生代谢生物合成有关的各种酶类，而调节基因则是控制结构基因表达强度和表达方式的一类基因。目前与类黄酮生物合成的主要结构基因和调节基因在多种植物中被克隆，主要结构基因编码的酶的生化作用机制也已被阐明［2］。尽管已有学者利用转基因技术，将控制类黄酮次生代谢的关键酶基因或其反义序列导入植物，通过促进或抑制该基因的表达，改变了类黄酮次生代谢途径，然而植物类黄酮生物合成途径是非常复杂的，涉及到的酶种类繁多，有时并不是一两个关键酶所能控制。通过转录因子作用，有可能激活类黄酮次生代谢途径中多个结构基因的表达，达到的效果将比导入某个结构基因的作用更明显。例如，黄酮醇的形成需要CHS,CHLF3H和FLS等基因的表达，要提高植物中该物质的含量，通过导入某个酶基因是很难实现的，Bovyw］等(2002)在番茄果肉中表达玉米转录因子基因Lc和CJ，结果与黄酮醇相关酶基因的表达含量显著提高，同时在转基因番茄果肉中，黄酮醇含量大概是对照的20倍。黄酮类生物合成途径生物合成基因黄酮类化合物是一种小分子酚类物质，广泛存在于植物界，具有多种生物功能，如：调节植物生长，保护植物免受紫外线的损伤，抗病虫等。花青素和黄酮类物质还具有较高的抗氧化活性，富含这两种物质的植物食品有利于人类健康和疾病预防。由于对这两条生物合成途径研究的较清楚，而且其生物合成途径的改变能很容易通过花色的改变来鉴定［4］。因此，自上世纪90年代早期，黄酮类和花青素的生物合成一直是植物次生代谢基因工程的一个主要目标。Chenb］等发现查尔酮异构酶是黄酮类代谢途径中的早期酶，也是增加黄酮醇产物的关键酶。.Davies^］等将矮牵牛CHI在番茄中超表达，导致转基因番茄果皮中黄酮类含量增加78倍、果肉中黄烷醇增加21倍。植株及果实的其它性状在转基因植株和对照之间没有区别。将查尔酮合成酶和黄酮醇合成酶基因导入番茄后，使这两个目标合成酶基因协同表达的转基因果肉中黄酮醇类物质积累显著增加［7］。这些结果表明了应用基因工程技术使目标酶基因在番茄果实中超表达，增加番茄果实中有益于人体健康的化合物的生物合成量是可行的。豆类植物的异黄酮是一类植物抗毒素，在植株受微生物侵染后，这些抵抗微生物的活性化合物可被诱导合成［8］。正常情况下，拟南芥、烟草和玉米等植物缺少合成这类化合物的能力。何水林［9］等将一种细胞色素P450单加氧酶——异黄酮合成酶的基因导入这些植物，使该基因超表达，这些转基因植物均能合成异黄酮类物质。因此，苯丙烷类代谢途径的基因工程可进一步应用于提高异源植物中异黄酮的生物合成（杨致荣等［10］）。转录因子植物代谢途径大多是由多种酶参与的多步反应，受发育、环境等因素的影响，对单个基因进行修饰有时难以奏效。研究发现一些转录因子可调控多个参与代谢途径基因的表达，例如，MYB类转录因子就参与了黄酮类物质的生物合成的调节（杨致荣等［ii］）。田文中等［12］通过转录因子的分子操作，调控植物代谢途径中目标代谢物合成的尝试已取得了成功。在玉米籽粒中，两种转录因子即R和C1通过共同作用调节着花青素生物合成。•梁辉等［13］将转录因子R和C1在离体培养的未分化玉米细胞超表达，成功地诱导了完整的黄酮类合成途径。在水稻中，玉米转录因子R、C1和查尔酮合成酶基因的协同超表达也激活了花青素生物合成途径，增强了对真菌的抗性［14］。曾明等［15］应用TDNA激活标签技术在拟南芥中鉴定出一种MYB类转录因子，它的超表达能激活许多参与花青素生物合成途径的基因表达，使植物体中紫色素的含量明显增加。有些转录因子则是植物体内自然产物合成的抑制子。采用基因沉默技术关闭这类转录因子的表达，就能促使相关化合物的合成。例如，拟南芥转录因子AtMYB4,是参与芥子酸酯合成的关键酶——桂酸4-单加氧酶（C4H）的抑制子。汪海峰等［16］将AtMYB4基因剔除，结果导致了C4H的大量表达，叶子中芥子酸酯增加，提高了抗紫外辐射的能力。刑建民等［17］克隆和鉴定了一个参与草莓果实黄酮类代谢途径的转录因子FaMYB1，该转录因子抑制黄酮类合成下游一些步骤。FaMYB1基因在烟草中的超表达引起了花青素和黄酮类化合物减少。相反，抑制或降低FaMYB1就会增加花青素和黄酮类化合物的积累。上述这些例子表明，通过一种或几种转录因子的超表达,可以改变植物生长发育过程中自然产物的合成和积累，甚至在异源植物种中也是可行的。植物次生代谢图谱植物次生代谢图谱（图1）的研究是一项非常复杂和巨大的工程，它包括次生代谢途径的中间产物和终产物的来龙去脉，参与各步反应的酶和基

因的表达与调控，以及次生代谢产物产生的细胞学定位等等。迄今，在庞大的植物次生代谢途径网络中，已明确功能的酶和已克隆的基因是极其有限的。黄酮类次生代谢产物的生物合成途径（图2）”1，是目前研究得较为透彻的次生代谢途径之一用2黄酮类化合物生成合成简图箭头颜色与转录因子颜色相对应，颤色相同表示催化该步反应的酶受该转

录因子的调控。为研究植物次生代谢中物质的流向，c13标记的底物饲喂法。一直是常用的方法。植物悬浮培养细胞，能够有效利用环境中的底物合成产物，而成为底物饲喂法中的一个重要工具。根和芽培养物的应用，解决了在培养细胞中不能表达的某些次生代谢途径的问题，也成为目前研究植物次生代谢途径的有效手段之一。另一比较便捷而有效的方法是将酶从植物中提取出来，与底物共同培育，检测生成的产物，由此推导出物质的流向［18］。植物次生代谢途径中，酶控制着物质流向，其作用是必不可少的，而酶的作用又离不开基因的调控。科技的发展，已经使基因水平的操作成为现实。酶及其基因的表达调控研究是复杂而细致的工作。基因的分离与克隆是研究其表达调控的基础，应用在植物次生代谢途径研究中的方法主要有差别筛选法、转座子标签法和微生物突变互补法。得到与目标代谢途径相关的突变体是这些基因克隆方法的关键。突变体的产生往往是由于基因水平的变化引起，利用突变体与野生株之间的基因差异，可以筛选到与代谢途径有关的新基因，为代谢途径的研究开辟新的天地。利用已知的关键酶的氨基酸序列的保守区域，设计兼并引物，克隆在其它物种中已知的某个基因，是在新的物种中展开次生代谢研究工作的常用方法［19］。黄酮类化合物生成基因工程的策略黄酮类化合物生成基因工程中，大多是通过转入某些关键酶的基因或其反义基因，促进或抑制该基因的表达，而引起植物次生代谢产物发生改变。此类报道有很多，如赵淑娟等［20］在开白花和深粉红色花的矮牵牛变种中转入苜蓿的查尔酮还原酶，分别得到了开黄色花和浅粉红色花的转基因植株。这是因为转入的查尔酮还原酶与受体细胞自身的查尔酮合成酶协同作用生成了异甘草根亭基质，而该化合物不能为矮牵牛的查尔酮异构酶催化，造成脱氧查尔酮衍生物的积累。然而，植物次生代谢途径是非常复杂的，有时远非一两个关键酶所能控制。调控因子的应用和基因的协同转化是近几年来植物次生代谢基因工程中的一个新方向，显示出广泛的应用前景。基因添加通过基因工程提高控制某一特定次生代谢物合成的限速酶活性或在植物中引入新的次生代谢物合成途径，可提高转基因植物目标次生代谢物含量或合成外源次生代谢物"前一种策略可通过强启动子与关键酶基因的嵌合转化，后一种策略往往采用次生代谢物合成途径中下游一个或若干个有关酶基因的协同转化。何水林等［21］,将IOMT(异黄酮-4-0-甲基转移酶)基因与CaMV35S连接，转入苜蓿，在对照植株中，I0MT和其它有关异黄酮合成酶的基因仅在病原菌诱导后表达，而转基因植物在病原菌侵染后IOMT基因的快速组成型表达使其较对照合成苜蓿素的速度快且产量高，相应地，抗病水平也有显著的提高。将次生代谢物合成途径的下游关键酶基因转入目标植物，在植物细胞内存在反应底物的时，外源基因的表达可使转基因植物启动新的次生代谢物合成支路。将拟南芥的IFS基因转入烟草和玉米等非豆科植物，可将柚皮素转化为染料木黄酮、大豆黄素等仅存在于豆科植物的异黄酮类植保素［22］。基因的剔除对于部分不利于营养品质或加工品质提高的植物次生代谢物，可通过反义基因的遗传转化抑制其合成途径中有关基因的表达，减少植物合成特定次生代谢物，从而提高植物产品的品质。例如，通过反义基因技术，可降低饲料和树木中木质素含量，从而提高饲料的饲用价值和木材的造纸质量和效益。通过CCoAOMT反义基因的遗传转化，有效地降低了转基因烟草中木质素含量。对黄酮类物质代谢的基因剔除目前还有待研究。调控因子的作用植物次生代谢产物的生物合成，大多是由多种酶参与的多步反应，在此过程中调控因子往往具有牵一发而动全身的功能。研究表明，转录因子的调控在黄酮类化合物的生物合成中具有重要作用。Walker等測］在大麦培养细胞中表达异源转录因子cl和R基因，使得正常状态下无色的细胞中出现了蓝色素)的积累。这是因为在蓝色素的生物合成起作用的大部分酶类，在cl和R基因表达的MYB蛋白和bHLH蛋白的协同调控下，催化代谢向蓝色素生成的方向进行。3-脱氧黄酮的合成需要另一MYB型的转录因子——P因子的调控，它是独立于c1和R因子的转录调控因子。异源P基因在大麦培养细胞中表达，导致了不同于cl，R因子调控的黄酮类化合物的积累。因此，合理利用调控因子，将可能成为今后植物次生代谢基因工程的有效手段。参与类黄酮次生代谢的转录因子黄酮类次生代谢生物合成途径涉及的反应步骤多，而且类黄酮在植物组织中含量一般较低，检测难度大，因而对与黄酮类次生代谢有关的转录因子的分离、鉴定困难较大。但是，随着分子生物学和基因工程技术的迅猛发展，目前已在一些植物中发现了调控类。黄酮生物合成途径的调节基因，并且用转座子标签法等技术克隆了部分编码转录因子的基因如今，人们已在玉米、拟南芥、矮牵牛、水稻等作物中，分离、鉴定了调控黄酮类次生代谢的转录因子基因，分别属于编码M'1q3、MYC、bZIP蛋白、WD40蛋白、锌指蛋白等各种类型基因家族。它们大多是控制花色、种皮颜色等表型易于检测的性状，因为控制这些性状的转录因子基因便于应用转座子标签、T．DNA激活标签或图位克隆等方法进行分离。这些转录因子能够通过与结构基因启动子中含有的能被其识别的顺式作用元件结合，从而激活类黄酮生物合成途径中多个基因的表达，有效地启动类黄酮生物合成途径。在目前已被分离、鉴定与调控黄酮类次生代谢有关的转录因子中，人们对MYB和MYC(bHLH)两大类转录因子家族的研究较为深入［24］。3.4基因的协同转化矮牵牛AN2、玉米C1、拟南芥的PAPI/PAP2等R2R3—MYB转录因子不能单独调控花色素合成的结构基因，而必须在有另外一类转录因子(bHLH)存在的情况下才能发挥功能。此外，在拟南芥中转录因子基因TTG2、与TTGl、m、m一起调控原花色素的合成，m编码的MYB蛋白激活类黄酮合成途径中后期相关酶基因的表达，但是需要依赖bHLH型转录因子TT8的作用，共同控制DFR和BAN基因的表达。在玉米中，MYB型转录因子C1/PI和bHLH型转录因子RfB协同控制玉米类黄酮生物合成途径结构基因的表达。利用次生代谢途径中几种酶的协同作用，可以达到改造植物的理想目的，这为植物次生代谢产物的基因工程开辟了新的思路。植物转基因方法植物黄酮类转基因的方法很多，最为成功的主要有农杆菌介导的转基因技术和基因枪直接转基因技术。农杆菌介导的转基因技术农杆菌包括根癌农杆菌和发根农杆菌。根癌农杆菌Ti质粒和发根农杆菌Ri质粒上Vir区表达的蛋白质，可以将质粒上的T.DNA转入植物细胞，并经同源重组，整合到植物的基因组，在植物细胞中表达。利用T-DNA的转移机理，科研工作者成功地构建了将外源基因转入植物细胞所用的双元载体，使它成为植物转基因的有效工具。植物次生代谢基因工程中，这一技术已得到广泛应用，尤其是转基因毛状根培养技术。利用发根农杆菌感染药用植物形成的发根，生长速度快，遗传稳定性强，是颇有潜力的培养系统，至今已在31科100多种植物上取得了成功。在研究LeDI.2功能的过程中，Winkel等［25］利用发根农杆菌(A.rhizogenes)将LeDI.2的反义DNA转入紫草细胞，得到了紫草宁含量减少的毛状根。赵淑娟等，获得的转GBSSI基因的黄芪毛状根，其多糖含量和黄酮类化合物含量有所改变。基因枪直接转基因技术。基因枪技术的特点是：①由于根癌农杆菌仅对某些双子叶植物敏感，而对多数单子叶植物不敏感，从而限制了根癌农杆菌Ti质粒介导法等的应用范围，而基因枪法不受宿主限制、宿主可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物。②受体类型广泛。该法不仅可以原生质体作为受体材料，而且同以完整细胞、组织等如叶片、茎或根的切段、幼胚、愈伤组织、花粉细胞等作为受体材料进行轰击转化。③可控度高。基因枪轰击过程中，可根据需要将射弹射入特定层次位置的细胞，有利于提高转化效率。④操作简单、迅速，但费用较高。操作需要基因枪和组织培养条件即可。目前普遍用于黄酮类化合物基因工程中。结语与展望类黄酮次生代谢途径中，特定产物的生成与否、量的多少主要由参与其合成的多个酶蛋白的活性所决定，而这些相关酶的表达受到相应的转录因子调节。转录因子通过激活类黄酮次生代谢途径中多个酶基因的表达，可有效地启动或关闭次生代谢合成途径，从而调节特定次生代谢物的形成。转录因子的基因工程是类黄酮次生代谢遗传改良的有效途径，随着植物次生代谢调控机制的阐明，特别是随着调节特定次生代谢物合成的转录因子的分离和功能鉴定，转录因子基因工程将为人类开发利用类黄酮次生代谢物这一巨大的宝库提供更为有效的手段。同时类黄酮生物合成过程的调控是很复杂的，类黄酮生物合成还与环境刺激因子如光、温度和营养供给有关；此外也受内部因子的作用，如生长调节因子、代谢物以及组织特殊发育阶段的影响。不同的调控因子控制了生物合成途径的不同部分，不同的调控因子之间也存在着相互作用，而这些调控机制仍需要进一步研究［26］。总之，研究类黄酮的生物合成及其基因调控模式，将有利于我们更好地采用基因工程手段改良植物类黄酮次生代谢途径。参考文献：AtchleyW.R.WollenbergK.R.FitchW.M.TerhalleW,DressA.WCorrelationsamongaminoacidsitesinbHLHproteindomains:aninformationtheoreticanalysis2000BorevitzJ.O.XiaY.BlountJ.DixonR.A,LambCActivationtaggingidentifiesaconservedMYBregulatorofphenylpropanoidbiosynthesis2000BovyA.deVosR.KemperM.SchijlenE,AlmenarPertejoM,MuirS,CollinsG,RobinsonS,VerhoeyenM,HughesS,Santos-BuelgaC,vanTunenAHigh-flavonoltomatoesresultingfromtheheterologousexpressionofthemaizetranscriptionfactorgenesLCandC12002YangZR(杨致荣),WangXC(王兴春),LiXM(李西明),YangCD(杨长登)(2004).Advanceonthestudyoftranscriptionfactorsinhigherplants.Hereditas(遗传),26(3):403-408(inChinese)ChenDH,YeHC,LiGF(2000).ExpressionofachimericfarnesyldiphosphatesynthasegeneinArtemisiaannuaL.transgenicplantsviaAgrobacteriumtumefaciensmediatedtransformation.PlantSci,155:179-185DaviesKM(2000).Plantcolourandfragrance.In:VerpoorteR,AlfermannAW(eds).MetabolicEngineeringofPlantSecondaryMetabolism.Dordrecht:KluwerAcademicPublishers,127-164何水林，郑金贵，黎红志#种植制度中作物他感作用及其应用.见：黄国勤，高旺盛，陈阜等，中国集约型农作制度可持续发展.南昌：江西科学技术出版社，2000.219~2248.何水林,植保素代谢与植物防御反应.广州：广东科技出版社，2002.1~259.石碧，狄莹,植物多酚，北京：科学出版社，1999.171~180,285~29010.杨致荣.毛雪.杨致芬.李润植CytochromeP450genesandtheirapplicationinplantimprovement[J]-HEREDITAS2003(02)杨致荣.王兴春.李西明.杨长登Advanceonthestudyoftranscriptionfa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