蛋白质的结构表达、纯化和结晶作用

ABriefViewofProteincrystallizationCrystal

蛋白质的结晶什么是晶体？晶体：由原子（或离子、分子）在空间周期排列构成的固体物质。如果原子（或离子、分子）是按照一种确定的方式在三维空间作严格的周期性的规律排列，即相隔一定的距离，周期重复出现，这样的物质称为晶体或单晶体。晶体一定是固体物质，但是固体物质不一定是晶体。

晶体的分布非常广泛，自然界的固体物质中，绝大多数是晶体。气体、液体和非晶态物质在一定条件下也可以转变成晶体。日常生活中的食盐、糖、水晶、宝石等均为晶态物质－晶体。非晶体：物质内部原子杂乱无章地分布，没有周期性排列的规律，此类固体物质称为非晶体或者称为非晶态物质。

玻璃、塑料、松香、陶瓷、生物制品、纤维、淀粉、多糖、无定形药物等，是固体中常见的非晶态物质。蛋白质的结晶如何形成晶体？ ProteinCrystals Thenatureofcrystals: Orderly(specific);Three-dimensionalarray; Non-covalentinteraction;Identicalunitcell

蛋白质结晶原理蛋白质在其溶液中的结晶其实是一种缓慢沉淀的过程。溶液中存在的作用力有疏水相互作用、静电力、氢键作用力等，当吸引力与排斥力达到平衡时溶液处于稳定状态。当吸引作用增大，或分散的或排斥的相互作用减小时，分子开始趋向与聚集状态。例如在液态环境中，如果生物大分子溶液很浓，没有足够的水维持其溶剂化作用，则分子可能聚集成非晶态沉淀，也可能结晶出来。常用的使蛋白质沉淀的方法是加入沉淀剂，这种方法是通过降低水的流动性来增加蛋白质的有效浓度。常用沉淀剂：聚乙二醇（PEG），盐（如硫酸铵）。另外一种方法：减小蛋白质分子间的排斥力或是增大他们之间的吸引力。如加入有机溶剂，改变溶液的PH，温度等。蛋白质的结晶Aphysicalchemist:“moleculesatalowerenergystateinthecrystallinelattice,aremoresecurethanaimlesslywanderinginspace.”

keypointsincrystallizationHomogeneity Higherpuritycanimprovethechanceofcrystallization,but…

PurityQuantity蛋白质结晶方法蛋白质的结晶蛋白质结晶方法整批结晶法透析法液液扩散法气相扩散法整批结晶法(batchcrystallization)

这是最古老也是最简单的蛋白质结晶的方法。该方法的原理是瞬间将沉淀剂加入蛋白质溶液中，使溶液突然达到高度饱和状态。如果运气好的话，晶体会逐渐从过饱和溶液中析出并且不需要其他步骤。蛋白质的结晶它将所要结晶的蛋白质与结晶剂按要求的浓度在实验开始时，就混合起来以达到所要的过饱和度。实验样液的体积在50μL～几个毫升左右。由于批量结晶的样液体积较大，所以此法并不适于对最佳结晶条件的探索实验。一种改进的方法叫微量分批结晶技术。蛋白质的结晶透析法（dialysis）

适用于对于大量蛋白质样品进行结晶。

微量透析法（liquid-liquiddiffusion）图a和图b中，蛋白质溶液保留在毛细管中。图c中，蛋白质溶液被甩到管底并与膜接触。图d和图e中，毛细管置于盛有渗析液的Eppendorf管中。蛋白质的结晶DialysisSaltingoutChangingbufferDesalting液液扩散法

熔点毛细管中的液液扩散图示为沉淀剂密度较大时——这种方法是在小孔毛细管中将蛋白质溶液与含有沉淀剂的溶液相互覆盖，让其自己缓慢扩散的过程。

——蛋白质溶液与沉淀剂以1:1混合。因此沉淀剂浓度应为最终所需浓度的2倍。蛋白质的结晶气相扩散法蒸发扩散结晶此法是使任何挥发性的组分在小液滴和大样品池间达到平衡，使蛋白质液滴中沉淀剂及蛋白质的浓度逐渐增加,达到过饱和状态,最终析出晶体。晶体生长的基本装置是Linbro多孔组织培养板及用二甲基二氯硅烷硅化后的玻片或塑料盖玻片。此法不但可节省样品而且可有效利用储存空间。蛋白质的结晶悬滴法使用带有空穴的盘子，蛋白质溶液的液滴悬挂在盖玻片的下方，盖玻片覆盖在密封有沉淀剂溶液的空穴上方。盖玻片的表面经过硅化处理以阻止液滴在玻璃表面的铺展。这种方法是利用气相平衡的原理，使任何挥发性的组分在小液滴和大样品池间达到平衡，使蛋白质液滴中沉淀剂及蛋白质的浓度逐渐增加，达到过饱和状态，最终析出晶体

非常适用于只有少量样品，却要筛选大量条件的情况。蛋白质的结晶悬滴法的四个步骤：

第一步,在作结晶实验之前，最好对蛋白质样品进行离心，以除去不溶解的蛋白和杂质,以减少不必要的成核中心,此外，对蛋白质样品进行超滤，也是值得推荐的。 第二步,采用“吹气法”除去培养晶体用的组织培养板和盖玻片上可能带有的灰尘。 第三步，在组织培养板的孔中加入0.2-0.5ml经过超滤的含沉淀剂及添加剂的缓冲液,作为池液,孔边缘涂上真空脂。第四步,吸1ul或2ul池液放到硅化后的盖玻片上,加等体积蛋白溶液至此池液上(这个体积比将决定平衡后的蛋白质浓度)，混合均匀，应避免气泡出现。第五步,翻转盖玻片盖在孔上,检查密封是否良好。上述方法中步骤2和4目前己可在自动化仪器中进行,但是,绝大部分拥有该仪器的实验室最终还是乐意采用手工方法。起始的条件实验常在感兴趣的区域(通常低于沉淀蛋白所需的浓度)进行，然后再进行实验条件的优化。一般的,蛋白质晶体生长所需的硫酸胺等沉淀剂浓度在理想浓度的1%或2%偏差范围内,但对于不同分子量的聚乙醇胺（PEG）则可宽松一些。晶体在数小时至数月后出现。通常，微晶可用作晶种以长出合用的晶体。坐滴法如果蛋白质溶液表面张力低，在悬滴法中蛋白质溶液在盖玻片上铺展而不能形成液滴，此时可用坐滴法。

蛋白质的结晶蒸发扩散结晶的另一种形式是坐滴法,坐滴中含池液和蛋白溶液各1－2ul。此方法对于以下情况非常适用：即使用非离子去垢剂作为添加剂表面张力较低时；或用聚乙二醇或乙醇作为沉淀剂(由于凝结等问题,悬滴体积趋于增大)时；反向扩散导致液滴增大时；或结晶条件已确定,需要大量晶体时。蛋白质结晶条件杂质、晶核及其他因素如温度、溶液PH值及振动等都会影响结晶过程。为使蛋白质结晶，要求：蛋白质纯度足够高，不含其他化合物。蛋白质分子表面性质相同，聚集形式均一。蛋白质溶解在合适的溶剂中。溶液达到过饱和，使蛋白质形成小的聚集体，作为晶体生长的晶核。晶核形成，晶体才开始生长。溶液的过饱和度要降至最低水平，避免太多的晶核产生。晶体生长尽量缓慢以便在结构中达到最大的有序度，方法：改变温度，蛋白质浓度等。蛋白质的结晶ProteinSampleProteinConcentration:5-20mg/mlSaltconcentration:aslowaspossible.Iftheproteinisnotsoluble,changethepHofthebufferoraddsmallamountsofdifferentsalts.Bufferconcentration:5-10mM,10-20timeslowerthanthebufferconcentrationusedinthewell.(100mMinthefirstscreen).Stabilizer:DTT,EDTAandproteaseinhibitors. Atypicalproteinbufferis10mMTEA/HCl,pH7.5,25mMNaCl,1mMDTT,1mMEDTAand1mMNaN3.

蛋白质的结晶Precipitantsusedinmacromolecularcrystallization1.Salts:(NH4)2SO4

2.Volatileorganicsolvents:Ethanol3.Longchainpolymers:PEG40004.Lowmolecularweightpolymersandnon-volatileorganiccompounds:MPDTable3.PrecipitantsusedinmacromolecularcrystallizationFactorsaffectingcrystallizationFormacromolecule:purity,stability,modification,etc;Somechemicalfactors:pH,precipitant,ionstrength,specificions,etc;Somephysicalfactors:temperature,crystallizationmethod,time,etc.蛋白质结晶的影响因素结晶蛋白质的纯度。获得高纯度的蛋白质是对其进行结晶的前提。Lin等通过采用FPLC快速液相色谱系统得到结晶级的蛋白质，同时发现用此法得到的蛋白质进行结晶，结晶的可重复性及获得晶体的衍射清晰度都大大提高。过饱和度。溶液的过饱和度是蛋白质进行结晶的驱动力，其本质就是过饱和溶液的实际溶解度与饱和溶液的溶解度即该蛋白质的溶解度之间的化学势的差值。过饱和度的高低决定了结晶过程中成核及晶体生长的快慢，从而决定了晶体质量的好坏温度。温度的变化会引起蛋白质溶解度的改变。研究表明，大多数的蛋白质的结晶是在4～22℃温度范围内进行。某些蛋白质的盐溶液在低温时的溶解度趋向升高，而在聚乙二醇及甲基丙二醇溶剂中的溶解度随温度降低而降低。pH值。蛋白质为两性物质，结晶体系pH值的变化对其结晶行为有着重要的影响。对于有些蛋白质分子如：E.coli的闭环腺苷酸激酶，如果不考虑所得晶体的晶型，则结晶可在较宽的pH值范围内进行，但是如果涉及特定的晶型，则对pH值的要求非常严格，通常其波动范围不超过1。一般来讲，越靠近最佳pH值，晶型越单一，所得晶体质量越高。结晶剂对于蛋白质的结晶，结晶剂的作用主要在于对溶剂水的影响而非对蛋白质分子的影响。一般来讲，结晶剂主要分为6类：①盐类，如：磷酸盐、硫酸铵等；②高分子直链聚合物，如：聚乙二醇PEG、聚乙烯醇PVA、聚乙烯吡咯烷酮PVP等；③小分子多元醇MPD类，如：2-甲基2,4-戊二醇；④有机溶剂类，如：乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、叔丁醇等；⑤磺酰类染料；⑥去离子水。在实际工作中，通常使用混合结晶剂以获得更好的实验效果。Homogeity:purityisveryimportant;Solubility:dissolveproteintohighconcentration;Stability:maintainproteinasstableaspossible;Supersaturation:alterthepropertiesofsolutionforsupersaturation;Association:trytopromoteorderedassociation;Nucleation:trytopromotetheformationofnuclei;Variety:tryasmanymethodsaspossible;

Liquidimpurities:avoidimpuritiesinthemotherliquid;Preservation:protectplateandcrystalfromshockanddisruption;Conclusions:someimportantprinciplesScreeningRoboticManualCheapReadilyavailableAllowsforcreativityMultitudeofconditionsHighlyreproducibleEasytodocumentandtrackdataLowerconsumptionofprotein结晶蛋白质的结晶CrystalMation蛋白质的结晶ProteincrystallizationisstillanartsDifficultyAvailabilityDifficultyStrategiesRandomSparsematrixGridWhenscreensfoundnothing,makesomechangestoyourprotein!RandomChoiceofcomponentsChoiceofconcentrations(missionimpossible?)Sparsematrix(biasedrandom)Grid-1Grid-2InterpretationofcrystallizationdropsWhenshallwecheckout 1)Aftersetup,within1hr 2)within12-24hr 3)eachdayinthefirstweek 4)onceaweek 5)onceamonthForaformalsetup,donnotfollowtherulesabove!动态光散射法Availability

盐晶

盐晶体通常具有很高的双折射和很高的密度,硬玻璃样的外表,因而易于区分；用衍射来鉴定,它在高分辨率下(通常6埃下什么也没有)

只有少数几个很强的衍射点。ResultsandwhatwemaydoChangeBufferResultsandwhatwemaydoCleardrop(afterweeks)1)Increaseconcentrations2)Leaveitforseeding3)WaitResultsandwhatwemaydoDustorbacteriagrowth1)Filterthesolutions2)AddNaN3ResultsandwhatwemaydoPrecipitates1)Wait2)Discard3)HalftheconcentrationsResultsandwhatwemaydoPhaseseparation1)OptimizationResultsandwhatwemaydoNeedle,plate,micro-shower,clusterCrystalsOptimizationSeedingResultsandwhatwemaydoPerfectcrystal遗憾的是宏观观察时很有序的(甚至是双折射)的真正蛋白质晶体可能在微观上仍不够有序而不能衍射,或只能达到较低的分辨率(低于4埃)AdvancementinProteincrystallizationAutomationHighThroughputNewfactors压力Sazaki等用双光束干涉仪测定了高压下的溶菌酶蛋白四方结晶及正交结晶的溶解度变化。实验表明，随着压力的增高其正交结晶的溶解度降低，而四方结晶的溶解度增大。可能是由于不同晶型的蛋白质分子的疏水亲水程度不同，随着压力的变化，与水的作用效果不同并反映出溶解度的变化的不同。因此，已有越来越多的研究者开始利用压力作为蛋白质结晶过程中的一个重要的调整参数以得到目的产物。Newfactors外加物理场蛋白质分子带有不同的离子和极性基团，当施加外加电场时有可能会引起带电分子在结晶体系中的分布的变化，从而导致结晶行为的变化。Taleb等以溶菌酶蛋白为实验对象，研究了外加电场对其结晶的影响，结果表明：在外加电场的作用下，溶菌酶蛋白的结晶成核速率较无外加电场时有所降低，但所得蛋白质晶体变大。也有人对应用外加磁场影响蛋白质分子的结晶进行了研究，发现磁场不仅能够影响结晶速率，而且可以通过抑制或加速某一生长方向的速率来改变最终获得晶体的晶型Newfact