小麦成熟胚培养及耐盐突变体的筛选

小麦成熟胚培养及耐盐突变体的筛选叶校成［淮北师范大学生命科学学院2009级生物工程］摘要：［目的］利用小麦成熟胚培养技术获得愈伤组织以实现其耐盐突变体的筛选，并且提高小麦成熟胚愈伤组织的诱导率。［方法］以煤生0308为材料，用正交试验的方法研究6-BA、KT、2,4-D3种营养物质对小麦愈伤的影响。［结果］表明2,4-D的浓度对愈伤的影响最大，6-BA对实验的影响最小，KT的影响介于二者之间。由正交分析结果可以得出最优培养基配方为：MS+2,4-D0.5mg/L+KT1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖3%+琼脂0.8%。关键词：小麦愈伤组织成熟胚正交法耐盐突变体StudyonCultureofMatureEmbryofromWheatandScreeningofSalt-tolerant

MutantsYeXiaoCheng[BiologicalEngineeringLevel2009ofHuaiBeiNormalUniversityLifeScience

College]Abstract：[objective]Theuseofwheatembryoculturetechnologyformaturecallustoachievetheirsaltresistancemutantsselection,andimprovingwheatmatureembryocallusinductionrate.[method]Tocoalborn0308formaterial,usingtheorthogonalexperimentmethod,thestudyof6-BA、KT,2,4-D3kindofnutrientstotheinfluenceofwheatinjury.[result]Theresultshowsthattheconcentrationof2,4-dontheinjurythemostinfluence,6-tominimalimpactontheBA,theinfluenceofKTbetweentwocomposes.Byorthogonalanalysisresultscanbeconcludedthattheoptimalmediumformula:MS+2,4-d0.5mg/L+KT1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+sugar3%+0.8%AGAR.Keywords:wheat callusmatureembryoorthogonalmethodtosaltmutant.、仁・前言小麦是世界上最重要的粮食作物之一，小麦成熟胚具有取材方便、不受季节限制等优点，已成功应用于小麦组织培养及遗传转化研究，可望取代幼胚成为小麦遗传转化的方便受体。中国盐碱地分布面积广，严重影响小麦的产量，因此小麦耐盐突变体的筛选队农业生产十分重要。近年来，小麦组织培养一直受到广泛关注，以小麦幼胚，幼穗，叶片，根等外植体进行培养都成功获得了再生植株。为了提高小麦成熟胚的出愈率和植株再生率，人们做了不少研究，而小麦成熟胚具有良好再生能力，种子保存期长，易获得，可用于较长时间的研究。所以本次试验以小麦的成熟胚为外植体源，3种激素九种不同激素配比的培养基进行试验研究。1、材料与方法1.1试验材料1.1.1植物材料小麦煤生03081.1.2试验器具超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、烧杯、广口瓶、记号笔、打火机1.2试验方法1.2.1材料的预处理将小麦种子浸泡在水中1天，试验操作前，将种子放在烧杯中用流水冲洗30min以上。1.2.2试验操作将盛有泡好的种子的烧杯转入超净台，向烧杯中加入75%乙醇，浸泡40S后，倒出乙醇；再向烧杯加入0.1%的升汞，浸泡8min，倒出升汞，使用无菌水冲洗3到5次，每次5min左右后放入培养皿备用。1.2.3培养基及其培养条件1.1.2培养基各种培养基的激素浓度如表1所示:表1、培养基激素浓度2,4-D(mg/L)KT(mg/L)6-BA(mg/L)9-10009-200.50.59-301.01.09-40.500.59-50.50.51.09-60.51.009-71.001.09-81.00.509-91.01.00.5基本培养基为：MS+蔗糖3%+琼脂0.8%（以上培养基PH均为5.8，在121°C下经1.1kg/cm高压湿热灭菌15min）温度25C左右的温室培养，每天光照14h。每周定期观察成熟胚额培养情况，愈伤组织的诱导情况、生长情况、是否污染等，并做好统计。2、结果与分析2.1愈伤组织培养情况培养一周后材料表面出现粘膜，出现了愈伤组织，呈少量白色和绿色的愈伤。第二到四周后，愈伤组织更加明显，诱导现象更明显，呈现黑色，青色的愈伤组织，有些出现了染菌的现象，处理完，余下的继续观察培养。表二为接种四周后培养基中诱导产生愈伤组织的材料统计表表2各培养基的统计结果

2,4-D(mg/L)KT(mg/L)6-BA(mg/L)接种数出芽数愈伤数死亡数愈伤率9-10004814102420.83%9-200.50.54617111817.74%9-301.01.0624413020.97%9-40.500.5848741088.10%9-50.50.51.0321214743.75%9-60.51.005714411571.93%9-71.001.045729864.44%9-81.00.50320151746.88%9-91.01.00.531125480.65%愈伤率=（愈伤数/接种数）X100%2.2实验结果的直观分析表见表3极差记为R。R1>R2>R3,说明三个实验因素对成熟胚培养的影响效果的大小为2,4-D的浓度对实验的影响最大，KT次之，6-BA对实验结果影响是最小的。2,4-D的最优浓度为0.5mg/L；对于因素KT的最优浓度为1.0mg/L；对于因素6-BA的最优浓度为0.5mg/L由正交分析得出最优的培养基配方为MS+2,4-D0.5mg/L+KT1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖3%+琼脂0.8%。表3直观分析表所在列因素12,4-D2KT36-BA4试验误差试验结果试验1111120.83试验2122217.74试验3133320.97试验4212388.1试验5223143.75试验6231271.93试验7313264.44试验8321346.88试验9332180.65均值119.84757.79046.54748.410均值267.92736.12362.16351.370均值363.99057.85043.05351.983极差48.08021.72719.1103.5732.3 由直观分析表做出的效应曲线图见表4随着2,4-D浓度的增加，诱导率先上升后下降，说明2,4-D的最适浓度在0.5mg/L附近，在研究范围内，随着培养基中KT浓度的升高，诱导率先降

低再升高，说明KT的最适浓度在1.0mg/L之后，随着6-BA浓度的增加，诱导率先上升后下降，最高点在0.5mg/L。当实验低于这个值的时候，诱导率随着其浓度增加增加，高于此值时候，诱导率随浓度的增加而减少，因此0.5mg/L是最适合的值对于2,4-D和6-BA。而KT的存在对培养基影响不大。表4效应曲线图2.4 由实验结果做出的方差分析表见表5将偏差平方和记为S。F比(2,4-D)>1，F比(KT)VI，F比(6-BA)V1，F比(试验误差)V1，利用正交小助手的帮助下分析，生长物质的影响对小麦愈伤组织的诱导率都不是太显著，只有2,4-D在KT)>S(6-BA)>S(试验误差)可知，因素影响的主次顺序为2,4-D0.5mg/L的时候对小麦组织的诱导率是最高的。在适当的条件下，包括预处理，时间，温度对小麦种子的出愈率都有好的影响。表5方差分析表因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性2,4-D4275.81822.9184.460KT941.49620.6434.4606-BA621.27620.4244.460试验误差21.90620.0154.460误差5860.5083、结论与讨论本次实验里，利用小麦成熟胚培养技术获得其愈伤组织以及实现耐盐突变体的筛选，其中本实验用正交实验设计的方法寻找最合适形成愈伤组织的因素和水平。以媒生0308为材料，讨论9种培养基和3种激素配比对小麦成熟胚离体培养的影响及用紫外灯光线照射所产生的耐盐突变体的筛选，然后根据实验数据进行一系列计算及其分析，得出结论2,4-D的浓度对愈伤组织诱导率影响最大，及最优的培养基配方是MS+2,4-D0.5mg/L+KT1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖3%+琼脂0.8%。参考文献【1】贺杰;常景玲;小麦成熟胚愈伤组织的诱导及植株再生体系的研究[J];安徽农业科学;2007年05期【2】唐宗祥;张怀琼;张怀渝;晏本菊;任正隆;影响小麦成熟胚形成