氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量

实验二.氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量093858张亚辉实验目的学习荧光分析法的基本原理和LS－55B发光分析仪的操作。学习同步荧光的操作，了解同步荧光的优点。实验原理荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光。利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法，称为荧光分析。在一定光源强度下，若保持激发波长九ex不变，扫描得到的荧光强度与发射波长九em的关系曲线，称为荧光发射光谱；反之，保持九em不变，扫描得到的荧光强度与九ex的关系曲线，则称为荧光激发光谱。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素有关。酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Try）、苯丙氨酸（Phe）是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分，可以用荧光分析法测定。它们的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象。同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，提高选择性。实验仪器和试剂LS-55型发光谱仪;移液枪（德国BRAND公司生产）;100ml容量瓶2支;废液池（烧杯）一只；氨基酸储备液：色氨酸20mg/l，苯丙氨酸20mg/l.双酚A;去离子水;实验步骤1．打开电脑和光谱仪主机，将仪器预热20分钟左右。设定仪器参数：全波长预扫描参数，用储备液在100ml容量瓶中配置溶液，加水定溶后，使得色氨酸浓度为O.lmg/l,苯丙氨酸lmg/l；对两种溶液进行预扫描，并记录扫描结果。同时查看其拉曼波长、瑞利散射波长、以及双倍频峰波长。2.从预扫描得到激发和发射波长的初步结果（200-600nm）,分别对两种氨基酸溶液测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱。激发光谱参数：扫描波长范围200-350nm。九（Phe）=287nm,扫描速度em=500nm/min,Ex—Slit二5nm,Em—slit二5nm，记录信息；九（Try）=357nm,扫描速em度=500nm/min,Ex-Slit二5nm,Em-slit二5nm,记录信息。发射光谱参数：扫描波长范围200-400nm；入（Phe）=206nm,扫描速度ex=500nm/min,Ex-Slit二5nm,Em-slit二5nm，记录信息；入（Try）=217nm,扫描速ex度=500nm/min,Ex-Slit=5nm,Em-slit=5nm,记录信息记住取文件名。同步荧光光谱：扫描波长范围200-350nm,△入（九-九）（Phe）=81nm，扫emex描速度=500nm/min,Ex-Slit二5nm,Em-slit二5nm,记录信息；△入（九-九）emex（Try）=140nm,扫描速度=500nm/min,Ex-Slit二5nm,Em-slit二5nm。（注意：由于物质的荧光性质受许多条件的影响,以上实验参数仅供参考,具体参数的选择视实际情况而定。）数据处理1.用实验获得的数据绘制双酚A的激发、发射、同步光谱图。2.从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值,以及它们相对应的峰高。在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。双酚A扫描激发波长在230nm和280nm两处出现最高峰,本实验选择230nm为最大激发波长。此外，激发波长曲线在300—320nm处出现了一个十分完美的峰,请注意,此峰由瑞利散射而产生,非激发波长峰。改变狭缝宽度，观察曲线有什么变化？

狭缝宽度从5mm增大到10mm时，检测信号明显增强；而当狭缝增大到一定范围时，检测到的信号强度不再变化。同步狭缝5同步狭缝10同步狭缝500六．讨论与思考1．对待测溶液进行预扫描的有何作用？从预扫描可以得到激发和发射波长的初步结果，利用我们得到的初步结果对参数进行设置，然后再测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱。2．观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？激发波长的整数倍处荧光发射光谱出现很强的倍频峰，该波长不适合于进行定量分析。3．同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因。同步荧光技术能简化光谱，减少光谱重叠和散射的影响，对荧光性质相近的化合物能提高测定的选择性和灵敏度。同步荧光法相对于激发和发射光谱，得到的峰比较窄，更明显。同步荧光光谱固定波长差，同时扫描激发光谱和发射光谱重叠波长处，同时产生信号。例如，丁省在450〜500nm激发光谱与发射光谱重叠，而同步荧光有较好的选择性，清晰地显示出光谱。SpectrumSpectrum丁省—同步荧光SpectrumSpectrum丁省—同步荧光4．通过两种氨基酸的化学结构，是否可以不经试验判断其荧光强度的大小次序。NH2NH2NH2NH2NH2NH2苯丙氨酸色氨酸从共轭角度看，体系的共轭度增强，荧光效率一般也增大。这是由于增大了荧光物质的摩尔吸光系数，n电子更容易被激发，产生了更多的激发态分子，使荧光增强。苯丙氨酸有4个共轭双键，而色氨酸有5个共轭双键，所以色氨酸的荧光强度大于苯丙氨酸的荧光强度。5．比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点1）仪器:紫外分光光度计荧光仪紫外分光光度计荧光仪原理:紫外分光光度法通过被测物质在紫外光区(200-760nm)的特定波长或一定波长范围内光的吸光度,对该物质及进行定性和定量分析。朗伯比尔定律A=kbc(A为吸光度，k比例常数，b为液层厚度，c为溶液浓度)荧光分析法利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。优缺点：紫外分光光度法提供的信息量比较少，虽然可以提供化合物的骨架结构和验证某些发色基团，但很难确定基团位置。荧光分析法影响因素A分子结构首要条件有吸收，含共轭双键，通常＞1个苯环刚性平面结构减少振动和碰撞去活给/吸电子基增/减荧光卤素重原子效应荧光大减＞环境因素激发态比基态极性大，溶剂极性增，则荧光红移并增强温度对其影响非常大。辐射跃迁与T几乎无关，非辐射随T显著增大。对有机弱酸碱物质影响大，不同型体情况不同＞猝灭效应碰撞猝灭及能量转移：主要是外部转换热效应，溶剂或溶质分子间发生物理或化学作用导致荧光强度下降氧熄灭顺磁性氧分子，促系间跨跃成三重态自熄灭/自吸收自熄：浓度高时，激发态之间相互碰撞自吸：荧光与吸收曲线重叠，又被基态分子吸收七