第10章-蛋白质测定课件

第十章蛋白质和氨基酸的测定1、蛋白质概况蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等。在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。第一节概述蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉9.5%，兔肉21%，鸡肉20%，牛乳3.5%，带鱼18.0%，大豆40%，面粉9.9%，菠菜2.4%，黄瓜1.0%，苹果1.4%构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，而在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食品供给。蛋白质（酸、碱或酶解）→氨基酸蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。2、测定蛋白质的意义各种氨基酸的分离与定量——色谱技术。有多种氨基酸分析仪。氨基酸总量——酸碱滴定-甲醛法测定。另外还有茚三酮光度法、非水滴定法、邻苯二甲醛荧光法、乙酰丙酮和甲醛荧光法、三硝基苯磺酸法等4、氨基酸的测定第三节蛋白质的定量测定由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中只介绍前三种。一、 凯氏定氮法（一）常量凯氏定氮法样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。①用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。②也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。1、原理

整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定

1.消化2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4（NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O浓硫酸的脱水性和氧化性2H2SO4+C=2SO2↑+2H2O+CO2↑

（2）加硫酸铜作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。（3）加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。（1）加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点340℃，加入硫酸钾之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。2.蒸馏（2）用过量已知量的H2SO4或HCl

标准溶液吸收，再用NaOH标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂（红→黄）。吸收滴定3.吸收与滴定（1）用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂pH5.1）国标用亚甲基蓝+中性红（pH7.0绿→紫蓝）。指示剂红色→绿色→红色

（酸）（碱）（酸）②消化时不要用强火，应保持缓和沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。说明：①所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。操作方法：158页⑤当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢2—3ml后再继续加热消化。③消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。④样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动⑥—般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品．如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。⑦蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。（氢氧化铜在70～90℃时发黑）。CuSO4作用：蒸馏时碱性指示剂（二）微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：加入硼酸量50ml10ml,滴定用盐酸浓度0.1mol/L0.01mol/L,可用微量滴定管。10-210-2（三）自动凯氏定氮法1、原理及适用范围同前2、特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化8个样品（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收二、双缩脲法1.原理脲（尿素NH2—CO—NH2）加热至150~160℃时，两分子缩合成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络合物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键—CO—NH—，与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化.2.方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。3．绘制标准曲线用标准样：采用凯氏法测出的蛋白质样品。对紫外光有吸收作用在280nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。三．紫外吸收法1．原理：利用蛋白质的特有基团，2．适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。简称三胺，又叫2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪、1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺、2,4,6-三氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。四．三聚氰胺检测三聚氰胺性状为纯白色单斜棱晶体，无味，溶于热水，，微溶于冷水。主要用途三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂（MF）的原料。用于装饰板材、涂料、器皿的制造。三聚氰胺是一种低毒的化工原料。动物实验结果表明，其在动物体内代谢很快且不会存留，主要影响泌尿系统。《国际化学品安全手册》说明：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。在现有奶粉检测的国家标准中，主要进行蛋白质、脂肪、细菌等检测。三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，所以现有标准不会包含相应内容。亦即三聚氰胺检测目前并无国家标准。食品中蛋白质含量的检测一般测出食品中的含氮量（N约为16％），就可以推算出其中的蛋白质含量。要是蛋白质不够多，说明牛奶兑水兑得太多。牛奶和奶粉添加三聚氰胺（N约为66.6％），主要是因为它能冒充蛋白质。三聚氰胺的检测方法1、阳离子交换柱/高效液相色谱测定乳与乳制品中的三聚氰胺采用ZORBAX300SCX强阳离子交换色谱柱分析三聚氰胺，在不含离子对试剂的简单流动相下能够很好地控制三聚氰胺的保留；且该方法对三聚氰胺的选择性好，为乳与乳制品中的三聚氰胺检测提供了一个的快速、简便而可靠的液相新方法。美国，Agilent公司8～10min/sampleLD：10μg/g2、HPLC-UV检测三聚氰胺方法美国食品药品监督管理局(FDA)和中国农业部需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离，采用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱，可以得到良好的分离效果。LD：2μg/g3、LC-MS检测三聚氰胺方法由FDA（FoodandDrugAdministration美国食品及药物管理局）公布的HPLC-UV方法中，流动相添加了离子对试剂，因此限制了液质联用方法的使用；但不用离子对试剂色谱方法，三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差，不能得到较好的分离定量。基于此问题，艾杰尔科技公司自主开发了新的方法，采用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱，不用离子对试剂也能得到有效的保留与分离。因此方法中流动相不含离子对试剂，可以用于质谱检测。艾杰尔科技公司LD：0.5μg/g第六节氨基酸定量测定一．氨基酸的一般定量测定（一）甲醛滴定法氨基酸具有酸性的羧基（一COOH）和碱性氨基（一NH2）相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，一NH2与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定一COOH，并用间接的方法测定氨基酸总量。（二）茚三酮比色法氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化台物(除脯氨酸外均有此反应)，该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。

二．个别氨基酸的定量测定介绍了8种氨基酸的定量测定方法。P179~186第七节氨基酸的分离与测定一．薄层色谱法取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。

双向展开：二、气相色谱法

将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色谱分析的衍生物——三氟乙酰基正丁酯。它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐(TFAA)的酰化两个步骤。将酰化好的氨基酸衍生物进行气相色谱分析。

三、高效液相色谱法由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，因此用HPLC法测定氨基酸时，需要对氨基酸进行衍生化后，才能用紫外和荧光检测器进行测定。氨基酸的衍生可分为柱前衍生和柱后衍生。在HPLC测定中，更多的是采用柱