接种分离纯化与培养

接种分离纯化与培养第1页，课件共60页，创作于2023年2月遗传（heredity

）:上一代生物将自身的一整套遗传基因稳定地传递给下一代的特性。变异（variation）：

生物体在某种外因或内因的作用下，发生遗传物质结构或数量的改变，而且这种改变稳定，具有可遗传性。遗传与变异遗传保证了微生物种的相对稳定性、种的存在和延续，而变异则推动了种的进化和发展。第2页，课件共60页，创作于2023年2月遗传型和表型遗传型（genotype）表型(phenotype)某一生物体个体所含有的全部遗传因子，即基因的总和

，又称为基因型。某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和。

表型的实现是由生物体的遗传型和环境条件共同作用的结果。第3页，课件共60页，创作于2023年2月一、微生物遗传与变异的物质基础1.微生物的遗传物质是核酸，核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),除少数病毒的遗传物质为RNA外，其余均为DNA。2.除少数病毒的DNA为单链外，绝大多数微生物的DNA是双链的双螺旋结构。DNA存在于染色体与质粒上第4页，课件共60页，创作于2023年2月

（一）染色体染色体是遗传信息的主要携带者，是由脱氧核糖核酸(DNA)和组蛋白组成。不论是真核细胞还是原核细胞，它们的大部分DNA都集中在细胞核或核区（核质体）中。但真核细胞的细胞核有核膜包裹，形态固定的真核，核内DNA与组蛋白结合在一起形成一种在光学显微镜下能见的核染色体；而原核细胞只有无核膜包裹的呈松散状态存在的核区，其中的DNA呈环状双链结构，不能与任何蛋白质第5页，课件共60页，创作于2023年2月

相结合。不论真核微生物的细胞核还是原核微生物细胞的核区都是该微生物遗传信息的大本营和信息库，因此被称为核基因组、核染色体组或简称基因组。再从细胞内的染色体数目来看，不同的微生物的染色体数目差别很大，真核微生物常有较多的染色体，如酵母菌属中有的种有17条之多，而原核微生物中常只有一条裸露的环状DNA大分子核酸，即一条染色体。第6页，课件共60页，创作于2023年2月

基因是生物体内具有自主复制能力的最小遗传功能单位。基因（遗传因子）是遗传的基本单元，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。基因的实质是一条具有特定核苷酸序列的核酸分子片段。染色体是由众多基因所构成的。每个基因大体在1000～1500bp的范围，相对分子质量约为6.7×105。有关基因的概念和种类是遗传学中内容最丰富、发展最迅速的热点之一。第7页，课件共60页，创作于2023年2月二、质粒（Plasmid）1）质粒为染色体外的遗传物质，存在于细胞质中。为闭合环状的双链DNA，控制细菌某些特定的遗传特性。2）例如：耐药因子、细菌素及性菌毛基本均编码在质粒上。3）质粒能进行独立复制，失去质粒的细菌仍能正常存活。4）质粒可通过接合（conjugation）或转化作用（transformation）等将有关性状传递给另一细菌。5）人工改造的质粒可作为基因工程载体。第8页，课件共60页，创作于2023年2月二、突变突变指细胞内遗传物质的分子结构或数量发生变化的现象。包括基因突变（又称点突变）和染色体畸变。基因突变（genemutation）:是指一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，涉及一对或少数几对碱基的置换、缺失或插入，因其发生的范围很小，所以又称点突变（pointmutation）。染色体畸变（chromosomalaberration）:是指染色体较大范围内结构的变化，如缺失、重复、倒位、易位等以及染色体数目的变化。1.突变第9页，课件共60页，创作于2023年2月同种碱基的置换不同种碱基的置换只涉及1对碱基被另1对碱基所置换1个或少数几个碱基对的插入或缺失，使该部位后面遗传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和转译错误的突变。遗传物质在染色体水平发生较大范围的变化DNA分子中1对或少数几对碱基的突变第10页，课件共60页，创作于2023年2月2．基因突变基因突变也称点突变，指的是染色体局部点位内的变化，涉及一对或少数几对核苷酸的增加、减少或替换。（1）碱基置换在DNA链上的碱基序列中一个碱基被另一个碱基代替的现象称为置换。碱基置换分为两种类型：一类称为转换，是指DNA链中嘌呤与嘌呤（A与G）之间或嘧啶与嘧啶（T与C）之间发生互换；另一类为颠换，是指DAN链中一个嘌呤被一个嘧啶或一个嘧啶被一个嘌呤所替换。第11页，课件共60页，创作于2023年2月

（2）移码突变在DNA序列中由于一对或少数几对核苷酸的插入或缺失而使其后全部遗传密码的阅读框架发生移动，进而引起转录和翻译错误的突变叫移码突变（图6-4）。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株。移码突变只属于DNA分子的微小损伤，其结果只涉及有关基因中突变点后面的遗传密码阅读框架发生错误。第12页，课件共60页，创作于2023年2月3.突变型的类型表型是指具有一定遗传型的生物体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的一切外表特征和内在特性的总和。基因突变的类型很多，从筛选菌株的实用目的出发，按突变体表型特征的不同，可把突变分成以下几种类型。第13页，课件共60页，创作于2023年2月(1)形态突变型形态突变型是指由突变引起的个体形态或菌落形态的变异。如细菌的鞭毛、芽孢或荚膜的有无，霉菌或放线菌的孢子有无或颜色变化，菌落的大小，菌落表面的光滑、粗糙，以及噬菌斑的大小或清晰度等的突变。第14页，课件共60页，创作于2023年2月(2)营养缺陷型野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法再在基本培养基上正常生长繁殖，只能在补充了相应生长因子的补充培养基上或在含有天然营养物质的完全培养基上才能生长的变异类型，称为营养缺陷型。营养缺陷型突变株在遗传学、分子生物学、遗传工程和工业微生物育种等工作中有着重要的应用。第15页，课件共60页，创作于2023年2月(3)抗性突变型指野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化学药物、致死物理因素或噬菌体具有抗性的变异类型。根据其抵抗的对象可分为抗药性突变型、抗紫外线突变型或抗噬菌体突变型等。它们十分常见且极易分离，一般只需要在含抑制生长浓度的某药物、相应的物理因素或在相应噬菌体平板上涂上大量的敏感细胞群体，经一定时间培养后即可获得。抗性突变型在遗传学基本理论的研究中十分有用，它常作为选择性标记菌株。第16页，课件共60页，创作于2023年2月(4)致死突变型致死突变型是指由于基因突变而造成菌体死亡的突变类型。通常可分为显性致死和隐性致死，杂合状态的显性致死和纯合状态的隐性致死都会导致个体的死亡。在单倍体生物中两种类型都会引起个体的死亡。

第17页，课件共60页，创作于2023年2月(5)条件致死突变型突变后的菌体在某种条件下可以正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在另一种条件下则发生死亡，这种突变型称为条件致死突变型。温度敏感突变型是最典型的条件致死突变型。有些菌体发生突变后对温度变得敏感了，在较窄的温度范围内才能存活，超出此温度范围则死亡。其原因是突变使某些重要蛋白质的结构和功能发生改变，以致会在某特定温度下具有的功能，而在另一温度下则无此功能。如有些大肠杆菌突变菌株能在37℃下生长，但不能在42℃下生长；噬菌体T4的几个突变株在25℃下有感染力，而在37℃下则失去感染力。第18页，课件共60页，创作于2023年2月(6)产量突变型通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株称为产量突变型。若产量显著高于原始菌株的称为正变株；而把产量显著低于原始菌株的称为负变株。筛选高产正变株的工作对生产实践极为重要，但由于产量高低是由多个基因决定的，因此在育种实践上，只有把诱变育种与重组育种和遗传工程育种很好的结合起来，才能取得良好的效果。第19页，课件共60页，创作于2023年2月4.基因突变的特点自发性菌种衰退的根本原因不对应性突变的性状与突变的原因无关系稀有性自发突变几率低（10-6~10-10）突变率：每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。（某一单位群体在每一世代中产生突变株的数目）独立性某基因的突变率不受它种基因突变率的影响可诱变性自发突变的频率可因诱变剂的影响而提高（10-3~10-6

）稳定性基因突变后的新性状是稳定的可逆性野生型菌株某一性状可发生正向突变，也可发生反向的回复突变。第20页，课件共60页，创作于2023年2月基因重组（generecombination）：将两个不同性状个体的基因通过一定的方式转移到一起，并发生重新组合，产生新的遗传性状的过程，称为基因重组(generecombination)或遗传重组。

重组：遗传物质在分子水平上发生的交换；杂交：在细胞水平上遗传物质的交换.

杂交必然包含着重组，但重组不仅限于杂交这一形式。4、基因重组第21页，课件共60页，创作于2023年2月原核生物的基因重组类型

4种形式：1）转化

2）转导

3）接合

4）原生质体融合第22页，课件共60页，创作于2023年2月四、菌种的选育一、菌种的自然选育二、诱变育种三、原生质体融合四、基因工程育种第23页，课件共60页，创作于2023年2月一、菌种的自然选育利用自发突变进行的育种工作

1.从生产中选育

2.定向培育优良品种一般指用特定因素长期处理微生物群体，同时不断地对它们进行移种传代，以达到积累并选择相应的自发突变株的目的。例：卡介苗（牛型结核分枝杆菌的减毒活菌苗）特点：选育时间长，工作量大，无方向性第24页，课件共60页，创作于2023年2月二、诱变育种诱变育种的基本环节第25页，课件共60页，创作于2023年2月诱变育种中的几个原则

指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。2个主要环节：诱变（随机）选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高。筛选（定向）设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。第26页，课件共60页，创作于2023年2月1.出发菌株（originalstrain）出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。

具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、标记明显等）；对诱变剂敏感野生型菌株；从生产中选育的自发突变菌株；诱变获得的高产菌株出发菌株的选择标准：出发菌株的来源：第27页，课件共60页，创作于2023年2月2.菌悬液的制备(1)选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂；

②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）(2)同步培养（生理状态一致）(3)菌龄：对诱变剂最敏感时期

营养细胞：对数期孢子或芽孢：萌发前期(4)菌悬液的制备方法

物理诱变：生理盐水配制化学诱变：缓冲液配制(5)菌悬液的浓度

酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL

细菌，放线菌孢子：108个/mL

第28页，课件共60页，创作于2023年2月3.诱变剂的选择及处理方法(1)诱变剂的选择（高效，简便）

物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便；

化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。

(NTG——超诱变剂）UV是最常用的一种诱变剂第29页，课件共60页，创作于2023年2月(2)剂量的选择

突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量,反而会使突变率下降。正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中。

在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为70~75%,甚至30~70%的剂量。UV的剂量:固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来确定剂量多少。最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能使变异向正突变范围移动的剂量。常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）第30页，课件共60页，创作于2023年2月(3)诱变处理方法单因素处理或多因素的复合处理：①同一诱变剂的重复使用；②两种或多种诱变剂的先后使用；③两种或多种诱变剂的同时使用.第31页，课件共60页，创作于2023年2月4.中间培养（CM，培养过夜）目的：克服表型延迟表型延迟（phenotypiclag）：表型的改变落后于基因型改变的现象.

分离性延迟：

突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯合状态，表型才能表现出来。

生理性延迟：

由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能表现出来。分离性延迟的原因:对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。生理性延迟的原因:当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程。

生理性延迟:第32页，课件共60页，创作于2023年2月5.突变株的筛选

初筛复筛(1)初筛（以量为主）（a）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性（b）根据平板颜色反应直接挑选透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）；抑菌圈法（抗生素）；变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）；沉淀圈法（外毒素）透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标）2.复筛（以质为主，定量测定）摇瓶培养，直接检测所需产物方法需简便、快速2步第33页，课件共60页，创作于2023年2月三、原生质体融合1.定义：通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。

融合子意义：打破了微生物的种界界限，可实现远缘菌株的基因重组。可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组的机会。可与其他育种方法相结合，如把常规诱变和原生质体诱变所获得的优良性状，组合到一个单株中。第34页，课件共60页，创作于2023年2月

两亲本菌株的选择和遗传标记的制作（选择不同的营养缺陷型，

（A:[a+b-],B:[a-b+]）对药物抗性差异）

原生质体的制备（高渗条件）

原生质体再生（测定再生率）

融合（PEG、离心沉淀、电脉冲等）

融合子的检出（直接检出法和间接检出法）

实用性菌株的筛选2.操作过程：第35页，课件共60页，创作于2023年2月

基因工程基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质DNA提取出来，在离体条件下用适当的酶进行切割后，把它与载体DNA分子连接起来形成具有自我复制能力的DNA分子——复制子，并将它转移到宿主细胞中扩增和表达。基因工程是20世纪70年代初诞生的一门崭新的生物技术科学。基因工程与当前发展的蛋白质工程、酶工程和细胞工程共同构成了当代新兴的学科领域——生物技术工程。生物技术工程的兴起为现代科学技术发展和工农业、医药卫生事业的进步提供了巨大潜力。基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤：目的基因的获得；载体的选择；目的基因与载体DNA的体外重组；重组载体导入受体细胞以及重组菌的筛选与鉴定（图6-8）。四、基因重组和杂交育种

第36页，课件共60页，创作于2023年2月第37页，课件共60页，创作于2023年2月1．目的基因的获得

利用各种不同的限制性内切酶切割下人们所需要的基因，也就是某些DNA片段。那里面含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。目的基因的获得是基因工程操作的关键。第38页，课件共60页，创作于2023年2月2．载体的选择

载体是携带目的基因并将其转移至受体细胞内复制和表达的运载工具。作为载体DNA分子，应具备以下几个条件。①是一个有自我复制能力的复制子。②能在受体细胞内大量繁殖，即有较高的复制率。③载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上。④载体上必须具有可供选择的遗传标记。第39页，课件共60页，创作于2023年2月3．目的基因与载体DNA的体外重组

目的基因用DNA连接酶连接到合适的载体上是DNA重组技术的关键。采用限制性内切核酸酶处理含有酶切点的目的基因DNA分子和载体DNA分子，可使两种DNA分子上产生相同的黏端。所以当两者混合时，凡是与黏端碱基互补的片段，就会因氢键的作用而彼此吸引，重新形成双链。这时，在外界连接酶的作用下，目的基因的DNA与载体的DNA片段之间进行共价连接，形成一个完整的有复制能力的环状重组载体。第40页，课件共60页，创作于2023年2月4．重组载体导入受体细胞上述由体外操纵手续构建成的重组载体，只有将它导入受体细胞内，才能使其中的目的基因获得增殖和表达。把重组载体导入受体细胞有多种途径。如若以重组质粒作为载体时，可以用转化的手段；若以噬菌体作为重组载体时，可以用转导的途径将重组载体导入受体细胞。只是含目的基因的DNA与噬菌体载体的重组DNA分子导入受体细胞，一般先需用噬菌体的蛋白质外壳对重组载体进行体外包装。第41页，课件共60页，创作于2023年2月5．重组受体细胞的筛选和鉴定受体细胞经转化、转导处理后，真正获得目的基因并能有效表达的重组受体细胞一般来说只是一小部分，而绝大部分仍是原来的受体细胞或者是不含目的基因的重组受体细胞。为了得到真正的重组受体细胞，需要对其进行筛选和鉴定。经过筛选所获得的受体细胞就是所谓的“工程菌”。

第42页，课件共60页，创作于2023年2月

除此以外，基因工程在食品、化工、环保、采矿、冶炼、能源和材料等众多领域的广泛应用，必将在人类实践中发挥重大作用和贡献。当然，它也和其他所有新生事物一样，在它给人们带来巨大利益的同时也面临着严峻的挑战。基因工程与传统生物技术的最根本的区别就在于前者是在基因水平上进行操作，改变已有的基因甚至创造新的物种，这是一项前无古人的崭新工作。因此，基因工程是否具有潜在的危害性，特别是转移至人体的基因是否会激活原癌基因，基因工程是否会导致出现新型病原生物等问题必然也成为人们关心和争议的焦点。但有一点可以肯定，人们既然能发明一种新技术，必然也将会有能力掌握这门新技术，使它朝着有利于人类进步的方向发展。

第43页，课件共60页，创作于2023年2月

一、菌种的退化与复壮（一）菌种的退化与防止

1．菌种退化的现象菌种的退化是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。菌种退化的具体表现有以下几个方面。五、菌种的衰退、复壮和保藏

第44页，课件共60页，创作于2023年2月①形态方面，包括分生孢子减少或颜色改变等。如放线菌和霉菌在斜面上多次传代后产生“光秃”现象，从而造成生产上用孢子接种的困难。②生产速度变慢。③代谢产物的生产能力下降，即出现负突变。如黑曲霉的糖化力、放线菌抗生素的发酵单位的下降，所有这些都对生产不利。④致病菌对宿主侵染能力的下降，如白僵菌对寄主致病能力的降低。⑤对外界不良环境条件（抗噬菌体、抗低温和抗高温等）抵抗能力的下降等。

第45页，课件共60页，创作于2023年2月2．菌种退化的原因菌种退化的原因是多方面的，但是在生产实践中，必须将由于培养条件的改变导致菌种形态和生理上的变异与菌种退化区别开来。因为优良菌株的生产性能是和发酵工艺条件紧密相关的。如果培养条件发生变化，如培养基中缺乏某些元素，会导致产孢子数量减少，也会引起孢子颜色的改变；温度、pH的变化也会使发酵产量发生波动等。所有这些，只要条件恢复正常，菌种原有性状就能恢复正常，因此这些原因引起的菌种变化不能称为菌种退化。菌种退化的原因主要有以下几个方面：第46页，课件共60页，创作于2023年2月

（1）基因突变

菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。当控制产量的基因发生负突变，就会引起产量下降；当控制孢子生成的基因发生负突变，则使菌种产孢子的性能下降等。一般而言，菌种的退化是一个从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体中只有个别细胞发生负突变，这时如不及时发现并采用有效措施，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，最后发展成为优势群体，从而使整个群体表现出严重的退化现象。因此，突变在数量上的表现依赖于传代，即菌株处于一定条件下，群体多次繁殖，可使退化细胞在数量上逐渐占优势，于是退化性状的表现就更加明显，逐渐成为一株退化了的菌体。

第47页，课件共60页，创作于2023年2月

同时，对某一菌株的特定基因来讲，突变频率比较低，因此群体中个体发生生产性能的突变不是很容易的，但就一个经常处于旺盛生长状态的细胞而言，发生突变的机率比处于休眠状态的细胞大得多。因此，细胞的代谢水平与基因突变关系密切，应设法控制细胞保藏的环境，使细胞处于休眠状态，从而减少菌种的退化。第48页，课件共60页，创作于2023年2月

（2）分离现象通过遗传育种获得的多核（或是单核）菌种，由于其DNA双链中仅一条单链发生突变，随着传代，其生产性状也将发生退化。这种退化是由于诱变获得的高产菌株本身不纯，高产突变只发生在一个核和一条DNA单链上，随着细胞分裂，核发生分离，因而突变基因与未突变基因发生分离，于是就出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株。第49页，课件共60页，创作于2023年2月

（3）环境条件环境条件是影响菌种退化的一个重要原因。如培养条件对菌种退化的影响，可用糖化酶产生菌泡盛曲霉来说明。泡盛曲霉经诱变得到的突变株，在3种不同培养基上连续传代10次，发现不同培养基和传代次数对淀粉葡萄糖苷酶的产量有不同影响。环境温度也是影响菌种退化的重要因素，例如，温度高，基因突变率也高；温度低，则突变率也低，因此菌种保藏的重要措施就是低温。第50页，课件共60页，创作于2023年2月3．防止菌种退化的措施由于菌种退化问题的复杂性，各种菌种退化的情况又不同，因此，防止菌种退化的措施也就显得复杂化和多样化。根据对菌种退化原因的分析，可以制定出以下一些防止菌种退化的措施。（1）合理的育种选育菌种时，应尽可能使用孢子或单核菌株，避免使用多核细胞；合理选择诱变剂的种类和剂量，以减少分离回复现象的发生；同时，在诱变处理后进行充分的后培养及分离纯化，以保证所获得的保藏菌种的纯度。这些可有效地防止菌种的退化。第51页，课件共60页，创作于2023年2月

（2）选择适合菌种生长的培养条件和外界环境菌种培养基的培养条件应适宜，才能使菌种生长健壮，减少退化的发生。营养不足和过于丰富对菌种生长均不利。比如芳香族化合物，能诱发绒毛状菌丝体形成扇形菌落，这种菌丝体在料床上易形成致密的白斑，导致产量下降；栖土曲霉3.942在培养时，发现培养温度从28～30℃提高到33～34℃，可防止它产孢子能力的退化。此外，由于微生物生长过程积累的有害代谢产物，也会引起菌种退化，故不应使用陈旧的培养物作为种子。第52页，课件共60页，创作于2023年2月

（3）控制传代次数由于微生物存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生而表现出来的，所以应尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少发生自发突变的几率。菌种传代次数越多，产生突变的几率就越高，因而菌种发生退化的机会就越多。对于生产菌种，要尽可能利用它们的有效保藏期，可以采取一次接种足够数量的原种进行保藏，在整个保藏期内使用同一批原种。第53页，课件共60页，创作于2023年2月

（4）采用有效的菌种保藏方法用于工业生产的一些微生物菌种，其主要性状都属于数量性状，而这类性状恰好是最容易退化的。因此，在实验室或生产上，选用合适的菌种保藏方法也可以有效防止菌种的退化。（5）对菌种可能遭受病毒的感染应保持足够的警惕对有疑问