海洋生物活性物质活性蛋白肽氨基酸

海洋生物活性物质活性蛋白肽氨基酸第1页，课件共96页，创作于2023年2月

鱼精蛋白是存在于许多鱼类的成熟精细胞中的一种碱性蛋白，分子量较小，大约为4000~10000，精氨酸占其氨基酸组成的三分之二以上

（一）海洋生物活性蛋白1、鱼精蛋白第2页，课件共96页，创作于2023年2月

鱼精蛋白的结构

鱼精蛋白的结构因鱼种不同而有差异，但是它们存在许多相似的特征，如N-端均为精氨酸或者丙氨酸，各种鱼精蛋白分子肽链中都含有4个较长的和2个较短的精氨酸簇，并且分别被特征性的残基Ser或Thr，Pro-Ile，Gly-Gly或Val-Val分隔开。以鲑鱼鱼精蛋白为例，其氨基酸的序列如下：

Pro-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Pro-Val-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Gly-Arg-Arg-Arg-Arg

第3页，课件共96页，创作于2023年2月鱼精蛋白的抗菌谱及其最小抑菌浓度

鱼精蛋白的抗菌谱

菌种鲱精蛋白鲑精蛋白PseudomonasfluorescensSerratiamarcesensProteusmorganiiEscherichiacoliSalmonellaenteritidisVibrioparahaemolyticusEnterobacterareogenesStaphylococcusaureusBacilluscoagulans

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+++产气肠杆菌金色葡萄球菌芽孢型乳酸菌C菌1931年McClean首先报道了鱼精蛋白具有抑菌活性第4页，课件共96页，创作于2023年2月鱼精蛋白的抗菌谱菌种鲱精蛋白鲑精蛋白B．Megaterium：巨大芽孢杆菌B．Licheniformis：地衣芽孢

B．SubtilisruberB．Subtilisniger枯草芽孢杆菌

B.Subtilismesentericus马铃薯芽孢杆菌

Lactobacillusplantarum胚芽乳杆菌

Lactobacilluscasei干酪乳杆菌

Streptococcusfaecalis粪链球菌

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++在中性和碱性条件下，对耐热芽孢菌、乳酸菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和革兰氏阴性菌均有抑菌作用，PH值7～9时最强，对热稳定(120℃，30min)。

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鱼精蛋白的抗菌机理

研究表明，鱼精蛋白主要是以分子中多聚精氨酸或多聚精氨酸与其他少数几个氨基酸以某种结构或形式与细菌细胞壁结合，破坏细胞壁中的肽聚糖的合成，从而达到抑菌的效果。

鱼精蛋白的抗菌性会受到很多因素的影响，比如食品的pH值、金属离子、有机成分、温度和时间等

第6页，课件共96页，创作于2023年2月

鱼精蛋白的临床药理作用

鱼精蛋白具有强碱性基团，在体内可与强酸性的肝素结合，形成稳定的复合物，从而使肝素失去抗凝能力。尚具有轻度抗凝血酶原激酶作用，临床一般不用于对抗非肝素所致抗凝作用。第7页，课件共96页，创作于2023年2月鱼精蛋白的安全性

小鼠急性毒性实验、蓄积毒性实验、小鼠骨髓微核实验、小鼠睾丸染色体畸变实验等的结果表明，鱼精蛋白的LD50＞10g/kg，蓄积系数K＞

5，对雄性小鼠骨髓微核率没有增加作用，对小鼠睾丸初级精母细胞染色体没有致畸作用。采用Ames法对鱼精蛋白的致突变性进行了试验，也未发现其具有致突变作用。第8页，课件共96页，创作于2023年2月（1）来源蓝藻（Cyanophyceae）、红藻（Rhodophyceae）、隐藻（Cryptophyceae）和少数一些甲藻（Pyrrophyceae）中，它是藻红蛋白、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白和异藻蓝蛋白的总称。按照光谱类型来分类，藻胆蛋白则可以分为六大类：异藻蓝蛋白B（APB）、异藻蓝蛋白（AP）、藻蓝蛋白（PC）、藻红蓝蛋白（PEC）、藻红蛋白I（PEI）和蓝藻中含藻尿胆素的藻红蛋白Ⅱ（PEⅡ）。2、藻胆蛋白螺旋藻的藻蓝蛋白紫球藻的B-藻红蛋白卤腥藻和念珠藻的C-藻蓝蛋白微藻藻胆蛋白的研究尤为重要比如藻蓝蛋白在可见光区620nm的吸收与紫外光区280nm的吸收之比大于4.5，而异藻蓝蛋白在可见光区650nm的吸收与紫外光区280nm的吸收之比大于4.0。第9页，课件共96页，创作于2023年2月（2）藻胆蛋白分子的组成藻胆蛋白是由脱辅基蛋白（载体蛋白）和四吡咯结构的色基（发色团）——藻胆素所组成。发现所有的色基均是与多肽链中的半胱氨酸残基以硫醚键共价结合，结合的方式分别是通过色基的A环或者D环单链相连，也有的色基A环和D环同时与脱辅基蛋白相连。在藻胆蛋白的色基分为：藻红胆素（PEB）、藻蓝胆素（PCB）、藻尿胆素（PUB）。（3）主要特点藻胆蛋白是一种古老的捕光色素蛋白质。组成藻胆蛋白的氨基酸发生了一些特异性修饰，使之免遭蛋白酶的水解。蛋白质的一种保护机制第10页，课件共96页，创作于2023年2月（4）生理活性1、R-藻红蛋白可以和胰岛素抗体产生特异的免疫反应，这表明R-藻红蛋白的构象或结构的某些部位和胰岛素有一定程度的相似，可能对糖尿病有一定的疗效。2、藻胆蛋白可以刺激人B-淋巴细胞的增殖反应，提高机体的免疫力。3、与血红素结构相似，在相似消化环境下，藻蓝蛋白可以和铁形成可溶性化合物，提高铁的吸收率。4、从螺旋藻中提取的藻蓝蛋白，动物实验表明它有极强的抗癌作用，尤其是对肝癌细胞。安全无毒，藻类含量极为丰富，食品色素和化妆品第11页，课件共96页，创作于2023年2月5、藻胆蛋白结合激光辐射，可以有效地杀伤肿瘤细胞。0.25mg/ml藻蓝蛋白处理小白鼠骨髓瘤细胞，与对照组相比，激光辐射后细胞存活率由15%提高到71%，且对骨髓造血具有刺激作用。提示可用于临床治疗血液病及血癌。低浓度的藻红蛋白，分别对人口腔8113癌细胞和小鼠S180瘤细胞的杀伤率高达75%和76%。这种光敏杀伤作用与藻胆蛋白的浓度规律附合曲线为：lgY=-0.1252973-0.2391394（X+0.52）以此可以推导治疗中藻胆蛋白用量和调节激光能量大小，以发挥最大的杀伤效能。第12页，课件共96页，创作于2023年2月海洋附着生物能永久或暂时性地黏附于各种固体表面,对海上生产、运输等都带来不小的麻烦。但另一方面,海洋附着生物所分泌的黏附物质在水下所展现出来的优异黏附性能是目前其他的粘合剂所不能取代的。目前主要有两类：贻贝的足丝蛋白(musselfootprotein)和藤壶胶(Barnaclecement)3、黏附蛋白第13页，课件共96页，创作于2023年2月藤壶属于节肢动物门、甲壳纲、蔓足目、藤壶科，是附着在海边岩石上的一簇簇灰白色、有石灰质外壳的小动物。藤壶，虽属甲壳动物，但成体却既不游泳，也不爬行，而是营固着生活。

藤壶粘液的粘性甚强，甚至藤壶的化石经过几千年的沧桑仍牢固地附着在其他物体上。人工合成这种粘液，可用来补牙，粘接建筑材料（又称超级水泥）；还可用来修船和粘接漏洞；在医疗上粘合伤口，手术开刀后只需涂上这种粘液即可。第14页，课件共96页，创作于2023年2月贻贝属软体动物门Mollusca、瓣鳃纲Lamellibranchia、翼形亚纲Pterimorphia、贻贝目Mytioida、贻贝科贻贝足丝中富含蛋白质成分,从外形上可以分为两部分,足丝纤维(byssus)和足丝盘(pad)。贻贝的足丝蛋白的粘合力及防水性能极强且无毒性,是现有任何粘合剂均无法比拟的,因此在医药、造船、涂料等行业具有广泛的应用前景。第15页，课件共96页，创作于2023年2月从加州贻贝和紫贻贝足丝中鉴定到至少8种足丝蛋白mfp,

分别为mfp-1～mfp-6、胶原蛋白preColD和preColNG。胶原蛋白主要构成贻贝足丝纤维的核心骨架部分并延伸至足丝盘;mfp-1则覆盖在整个足丝表面而构成足丝的保护外套,以防止海水的溶解及微生物的降解。mfp-2~mfp-6则主要定位于贻贝的足丝盘,是贻贝足丝用以和外界固体表面形成黏附的主要蛋白成分以上足丝蛋白分子量从5kDa(mfp-3)～240kDa(preCol-D)不等,但仍具有一些相似的理化性质,例如,它们的等电点相似,均为碱性蛋白(pI>9),并且成熟足丝蛋白大都含有大量的翻译后修饰的3,4-二羟基苯丙氨酸(3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine,DOPA)。第16页，课件共96页，创作于2023年2月MFP-1蛋白贻贝足丝纤维的主要成分,分子量达到了108kD。一级结构具有75～80个串联起来的十肽重复单元。其序列中通常含有2种修饰性氨基酸——DOPA和羟基脯氨酸。十肽重复单元是高度亲碱和亲水性的，且DOPA含量较高，通过交联和络合将大量铁离子变为坚韧而致密的涂层，保护其结构免受磨蚀和细菌等微生物的降解。mfp-1的糖基化和羟基化程度均非常高,肽链交联紧密,所以结构异常复杂，并且不同来源的mfp-1在结构上存在较大差异。

mfp-1在贻贝足丝中主要负责对足丝的保护,而非与外界的粘合作用。第17页，课件共96页，创作于2023年2月MFP-2蛋白

Mfp-2最早从地中海贻贝Mytilusgalloprovincialis的足丝中分离到,其分子量为45kDa；序列中同样含有DOPA,但含量较低(5mol%),

一个重要特征在于其序列中含有大量半胱氨酸因mfp-2主要定位在足丝盘,因此推测该蛋白可能与足丝盘黏附蛋白之间形成交联有关。第18页，课件共96页，创作于2023年2月MFP-3蛋白Mfp-3的DOPA摩尔分数较高，分子量为5~7kD，无重复单元，且富含精氨酸，这些残基有许多被修饰成4-羟基-L-精氨酸(R)。Mfp-3存在很强的蛋白多态性现象,例如,在加洲贻贝足丝蛋白中检测到mfp-3有20多种,氨基酸残基从42到54个不等,序列相似性较高。不同贻贝来源的mfp-3在其分子量,DOPA含量,序列方面均有有较高的相似性,特别是在其序列的C端,均存在一个Gly-Trp-Asn-X-Gly-Trp-X(X为Lys或者Asn)的七肽片段第19页，课件共96页，创作于2023年2月MFP-4蛋白mfp-4也是一种定位于足丝盘的黏附蛋白,是一类质量为93kD的蛋白质。mfp-4的序列中有36个富含组氨酸His(22mol%)的十肽重复片段;此外Lys、Arg以及Asp的含量也较高;表现在N端和C端分别含有16个富含Asp的十一肽重复片段。但DOPA的含量仅2mol%。推测这类大质量的蛋白质在足丝附着基中很可能是起稳定作用。第20页，课件共96页，创作于2023年2月MFP-5蛋白Mfp-5分子量9kDa左右，含74个残基序列中DOPA的摩尔分数达到30%。Mfp-5中超过1/3的残基是翻译后被羟基化或磷酸化修饰，其中酪氨酸羟基化作用转变为DOPA，或丝氨酸磷酸化作用转变为O-磷酸丝氨酸。研究发现，因含磷酸丝氨酸的蛋白质对钙的亲和力很强，被修饰后的磷酸丝氨酸有助于贻贝附着在毗邻的贻贝外壳上，解释了为何Mfp-5中含有如此高的O-磷酸丝氨酸。研究发现足丝蛋白的粘合性能与DOPA含量呈正相关。mfp-3和mfp-5因低分子量和高DOPA含量以及由此表现的强的粘合能力而成为贻贝粘合蛋白研究中最受关注的两个蛋白分子第21页，课件共96页，创作于2023年2月MFP-6蛋白Mfp-6也是一种定位于足丝盘中的黏附蛋白,分子量11.6kDa序列中含量最丰富的氨基酸是酪氨酸Tyr(20.2mol%),其次是Gly(14.1mol%),Cys的含量也较高(11mol%),且约有1/3的Cys保留了自由的巯基,但DOPA的含量不到5mol%mfp-6与足丝盘黏附蛋白的固化有很大关系,它能通过含自由巯基的半胱氨酸Cys介导足丝盘黏附蛋白分子中的DOPA之间形成交联结构。第22页，课件共96页，创作于2023年2月preColD和preColNG胶原蛋白preColD和preColNG主要构成贻贝足丝纤维的核心骨架部分(fibrouscore)并延伸至足丝盘mfp-4可能负责足丝纤维中的胶原蛋白与足丝盘的黏附蛋白之间的连接,同时在足丝盘黏附蛋白之间也发挥着连接作用。第23页，课件共96页，创作于2023年2月糖蛋白(glycoprotein)是指由链较短、往往带分支的寡糖与多肽链某些特定部位的羟或酰氨基以共价键形式连接的一类结合蛋白质，在生物体内广泛存在——糖生物学(glycobiology)。糖蛋白中的糖链对蛋白质的功能起重要修饰作用，如糖链影响蛋白质的构象、折叠、溶解度、半衰期、抗原性及其他生物活性。由于糖蛋白研究的复杂性，对海洋动物中糖蛋白的研究相对较少，近年来才陆续开展起这方面的研究工作，多集中在粗提物的生理、药理活性研究方面，对均一的糖蛋白的结构以及构效关系方面的研究报道则较少。

4、糖蛋白抗肿瘤第24页，课件共96页，创作于2023年2月生物活性肽是介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物，它小至由两个氨基酸组成，大至由数百个氨基酸通过肽键连接而成，具有十分重要的生物学意义。生物活性肽的生物学意义主要体现：吸收机制优于蛋白质和氨基酸（指小肽）具有氨基酸不可比拟的生理功能两类海洋生物多肽：天然存在与酶解得到的多肽（二）海洋生物活性肽第25页，课件共96页，创作于2023年2月天然存在的海洋生物活性肽的种类：海绵多肽、海鞘多肽、海葵多肽、芋螺多肽、海藻多肽、鱼类多肽、贝类多肽、海星多肽、海兔多肽等由于海洋的特殊环境，组成海洋多肽化合物的氨基酸除常见的氨基酸外，还有β-氨基异丁酸等多种海洋天然产物特有的氨基酸类型，具有多种生理活性1天然存在的活性肽第26页，课件共96页，创作于2023年2月1.1海鞘多肽海鞘(Ascidian)属于脊索动物门,海鞘纲与尾索动物亚门的另外两个纲称为被囊动物(Tunicate),约有2000种,海鞘是被囊动物中种类最丰富、含有重要生物活性物质最多的一类。第27页，课件共96页，创作于2023年2月海鞘多肽是存在于海鞘中的环肽，

1980年，从海鞘Lissoclinumpatella中首次发现的环肽ulithiacyclamide。脂溶性、抗癌活性对L1210鼠性白血病细胞，ID50为0.35μg/ml。

对L1210鼠性白血病细胞，ID50为0.35μg/ml，对人的ALL细胞线CEM，ID50为0.01μg/ml。

第28页，课件共96页，创作于2023年2月1981年Rinehart等从加勒比海和加利福尼亚海域的群体海鞘Tridiemmumsulidum分离到3种海鞘素didemnineA，B，C：它们对RNA病毒和DNA病毒的增殖有抑制作用，对白血病细胞和B16黑色素瘤细胞有毒性作用。其中didemnineB的抗癌作用最强，只需0.0011μg/ml的浓度就能抑制白血病细胞的生长，目前已进入临床试验，是很有发展前途的抗癌物质。B环七肽去氢膜海鞘素第29页，课件共96页，创作于2023年2月1.2海兔多肽海兔属于海洋腹足类软体动物。对海兔抗肿瘤括性肽的研究最早由Pettit小组以小鼠白血病／淋巴瘤模型P388为筛选体系，对耳状截尾海兔（dolabellaauricularia）进行系统的抗癌活性成分追踪分离，已分离到dolastatin1～18，多为环肤类，具有强烈抑制肿瘤细胞生长的作用。其中dolastatin3(2-9)对P388肿瘤细胞的ED50为2.7×l0-71μg·mL-1。机理：抑制微管聚合，促进其解聚，干扰肿瘤细胞的有丝分裂，对许多癌细胞有诱导凋亡作用，是一种细胞生长抑制剂(cytostasis)。环[脯-亮-缬-谷酰胺）Thz-(甘)Thz]第30页，课件共96页，创作于2023年2月化合物55,56是从海兔分离到的直链肽，对P388白血病细胞IC50:0.04ng/ml.第31页，课件共96页，创作于2023年2月化合物61是从海洋软体动物分离到的环肽kahalalideF

，对结核杆菌有极高的抑制活性。海洋环肽具有强的抗病毒和抗肿瘤活性,这些环肽主要来源于海鞘和海兔

第32页，课件共96页，创作于2023年2月1.3海葵多肽文献报道从海洋生物海葵中提取得到的溶细胞性活性肽有：(1)存在于16种海葵中的鞘磷脂抑制性碱性多肽,平均相对分子质量在15，000～21，000之间。(2)从Metridrumsenile属海葵中分离得到的具胆固醇抑制活性肽,其平均相对分子质量在80，000左右。第33页，课件共96页，创作于2023年2月1.4海绵多肽海绵多肽是存在于离海绵目、外射海绵目、石海绵目、软海绵目以及硬海绵目等海绵中的环肽化合物，目前已分离得到近40种。discoderminsA～D是从日本伊豆诸岛海域采集的海绵中获得，A可抑制枯草杆菌和奇异变形杆菌，具有抗炎作用。A～D均能抑制海星胚胎发育，且是磷酯酶A2的有效抑制剂，IC50为350～700nmol·L-1。第34页，课件共96页，创作于2023年2月1.5芋螺多肽芋螺(Conus)是海洋腹足纲软体动物,其在猎取鱼、海洋蠕虫、软体动物时常分泌一系列毒性物质,称为芋螺毒素(Conotoxin)即芋螺多肽。目前已发现的芋螺毒素有近百种，大多为由10～30个氨基酸残基组成的小肽，富含两对或三对二硫键，是迄今发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，也是二硫键密度最高的小肽。主要有α-芋螺毒素、μ-芋螺毒素、ω-芋螺毒素及δ-芋螺毒素等。其活性与蛇毒、蝎毒等动物神经毒素相似,可引起动物出现惊厥、颤抖及麻痹等症状花冠芋螺织锦芋螺番红花芋螺将军芋螺第35页，课件共96页，创作于2023年2月1.8生物防御素生物防御素(Defensin)是近年来发现的一组新型抗菌活性肽。它们通常都是由35～50个氨基酸残基组成,且分子内富含二硫键。由于其具有牢固的分子骨架、广泛的分布以及生物活性功能,因而对它们的研究已成为当前国际学术界中一个引人关注的研究热点。第36页，课件共96页，创作于2023年2月海藻多肽已从绿藻、蓝藻等中分离得到。据报道，利用绿藻水提物制得一种内含活性多肽成分。从培养的蓝藻中也分离出一种具有鱼毒性、抗菌、杀细胞活性的生物活性肽,已具备大规模生产能力。另外，还从海藻Pyymnesiumpatelliferum属中提取出一种毒素肽Hormothamin，从蓝-绿海藻属Lyngbyamajuscula中分离得到具有细胞毒活性的环肽MajusculamideC第37页，课件共96页，创作于2023年2月2水产食品中天然存在的活性肽

存在于鱼贝类组织中的天然肽类只有:三肽的谷胱甘肽；是一种特殊的Aa衍生物，又是含有巯基的三肽；鹅肌肽、鲸肌肽：属咪唑化合物，统称为咪唑二肽，是肉品风味的前体物质。

这些咪唑化合物一般在游泳能力强的鱼类及鲸类肌肉中含量较多，因为咪唑环的pK值在生理pH附近，被认为是具有缓冲作用的物质。第38页，课件共96页，创作于2023年2月

天然存在的活性肽大部分或含量微少,或提取难,不足以大量生产供给所需;化学人工合成又费时费力,成本昂贵;因此,人们更多地把目光投向开发蛋白酶解产物这条途径上来。3

通过酶解得到的活性肽水解营养蛋白生产生物活性肽的理论依据:

在贮藏、营养蛋白的多肽链内部可能普遍存在着功能区,选择适当的蛋白酶水解,这些多肽有可能被释放出来,从而制备各种各样的生物活性肽。目前，应用于酶解海洋动物蛋白的酶主要还是陆源蛋白酶，包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶、热菌蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胶原蛋白酶、木瓜蛋白酶等第39页，课件共96页，创作于2023年2月

从生物进化上看,营养和贮藏蛋白应该是从功能蛋白进化而来的,因为原始的生物是不可能合成大量此类蛋白的。当生物进化到需要为后代发育提供营养时,它不可能凭空制造出一种营养蛋白,最好的方法就是通过若干功能区(结构域,DomainDNA）“组装”出营养或贮藏蛋白基因。所以,在不同的营养和贮藏蛋白的多肽中可能广泛存在着不同的功能区,选择适当的蛋白酶就可将其释放出来,还原其功能特性,通过这种方法可以获得相当广泛的生物活性短肽。第40页，课件共96页，创作于2023年2月从免疫学看,尽管不同的生物都具有功能上非常相似的蛋白质,但是由于其非功能区存在着较大氨基酸差异,所以不能互相使用,因为生物正是通过免疫系统识别自身蛋白和外来蛋白的这些非功能区的差异来清除异己和保持自身稳定性的。如果我们把注意力放在这些具有不同生理功能的生物活性短肽上,则我们可能有效地避免免疫排斥反应的困扰。第41页，课件共96页，创作于2023年2月例如,乳转铁蛋白用于注射可能会产生免疫排斥反应,但如果用其水解所得到的短肽,就可能安全地用于注射。又如,实验证明免疫活性肽和白细胞介素相似,可以激活T细胞和巨噬细胞,从而增强机体免疫力,虽然它来源于动物蛋白,但研究表明它可能安全地用于医药。第42页，课件共96页，创作于2023年2月

4海洋生物活性肽生理活性

易消化吸收（比氨基酸更易吸收）、保护胃粘膜及抗溃疡作用、抗菌、抗氧化、抗过敏、降血压、降胆固醇、抗衰老、抑制肿瘤细胞生长、抑制AIDS病毒、促进伤口愈合、增强骨强度和预防骨质疏松、预防关节炎、促进角膜上皮损伤的修复和促进角膜上皮细胞的生长等第43页，课件共96页，创作于2023年2月

4.1降压活性

原第44页，课件共96页，创作于2023年2月活性评价方法活性评价方法：体外实验法和动物实验法。体外实验法：1971年Cushman建立了体外紫外光度法——在37℃、pH8.3即模仿体内环境的条件下,ACE降解血管紧张素I的模拟物Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)产生马尿酸，当加入降血压肽抑制ACE的降解作用后，马尿酸的生成量减小，通过在紫外228nm处测量马尿酸的光吸收值得到马尿酸的生成量，从而评价降血压肽的抑制效果。第45页，课件共96页，创作于2023年2月

从海洋低值鱼虾中分离出具有抗高血压活性的活性肽。其氨基酸序列如下:C8肽(沙丁鱼):Leu-Lys-Val-Gly-Val-Lys-Gln-TyrC11肽(沙丁鱼):Tyr-Lys-Ser-Phe-Ile-Lys-Gly-Tyr-Pro-Val-MetC8肽(金枪鱼):Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp-Gly-AspC3肽(南极磷虾):Leu-Lys-Tyr提高抑制血管紧张素转化酶ACE的活性而具有降压功能。水解Pr条件温和，食用安全性极高，突出优点是对血压正常的人无降压作用。第46页，课件共96页，创作于2023年2月

从鳕鱼排中分离得到的分子量分别为30K,10K,5K和3K的四种活性寡聚肽，具有ACE抑制活性，且ACE抑制活性随相对分子量降低而显著增加，分子质量为3K

的多肽具有最强的ACE抑制活性。此肽具有很好的水溶性，且无苦味，因此,更易投入实际应用。相对分子质量为5K的多肽具有显著的抗氧化活性,其抗氧化活性与α-生育酚相当。第47页，课件共96页，创作于2023年2月第48页，课件共96页，创作于2023年2月贻贝蛋白酶解降血压肽的降压活性及相对分子质量与氨基酸组成

1实验方法1.1选取复合蛋白酶P1，在不同酶解条件下对贻贝蛋白进行水解，采取UniformDesign(均匀设计)方案，研究不同酶量、酶解时间、酶解温度、pH等因素对ACE的抑制效果，并选择最佳的酶解条件。1.2酶解液经纯化、加入活性修饰剂MAl，提取，冷冻干燥，制备降血压肽，进行活性检测。文献阅读第49页，课件共96页，创作于2023年2月1.3酶解样品ACE抑制效果评价用紫外分光光度法分析不同酶解条件下制备的酶解降血压肽的ACE抑制活性。228nm下测定其吸光值。将各酶解液反应值与空白样品对照，分析所得酶解降压肽的ACE抑制率P：

P=[A-A(control)]/A×100％第50页，课件共96页，创作于2023年2月1.4高效液相色谱法测相对分子质量--标准曲线法色谱条件：Waters600高效液相色谱仪；色谱柱：TSKgel2000；流动相：V(乙腈)：V(水)：V(三氟乙酸)=45：55：0．1，检测波长：220nm，体积流量：0．5mL/min，柱温：30℃。相对分子质量校正曲线所用标准品：细胞色素c(MW12500)，抑肽酶(MW6500)，杆菌酶(MW1450)，乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)，乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189)。取酶解降血压肽溶解，定容，取上清液滤纸过滤，再用0．22um微孔滤膜过滤，以供进样。第51页，课件共96页，创作于2023年2月1.5降血压肽氨基酸组成分析水解氨基酸检测：取样品，加6mol/L盐酸水解，110℃，24h，然后用0．3mm膜微孔过滤，定容，进样氨基酸自动分析系统进行检测。游离氨基酸检测：取样品，加水溶解，超声波振荡混匀，加适量盐酸调酸，0.3mm膜微孔过滤，定容，进样氨基酸自动分析系统进行检测。1.6降血压肽的动物试验将样品以3.0g·kg-1体重的剂量进行灌喂。灌喂前和灌喂之后第2、4、6、8、10小时分别检测收缩压1次，记录各血压值。第52页，课件共96页，创作于2023年2月2结果及讨论2.1酶解条件对降血压肽ACE抑制率的影响

回归分析得回归方程：Y=70.464-1.195X1+15.299X2+11.971X3-4.310X22+0.194X1X2-0.141X3X4由此最佳的ACE抑制活性为90.23％，但试验结果ACE抑制率为86．55％。第53页，课件共96页，创作于2023年2月2.2降血压肽的相对分子质量组成检测结果

降血压肽样品相对分子质量范围在1.6ku以内，从1～1.6ku，即lO～15、16肽的范围，其含量为49.66％，0.6～1ku，即5～10肽范围，样品含量为15.73％，0.2～0.6ku范围内为7．96％，主要为2肽～4肽的小肽。目前比较公认的是酶解降血压肽的分子量相对于蛋白质来说较小，一般在几个ku以内。第54页，课件共96页，创作于2023年2月2.3降血压肽的氨基酸组成检测结果分析氨基酸组成与酶解质量和降血压活性之间的关系

样品含有较高比例的必需氨基酸

8.57水解氨基酸总量为59.6游离氨基酸总量为8.8谷氨酸被认为能促进脑细胞进行呼吸，利于脑组织中氨的排除，调节人体的新陈代谢，而这将会对血压造成一定的影响第55页，课件共96页，创作于2023年2月2.4降血压肽的降压效果

处理4h和6h血压变化的F值>0.05(2，9)，说明服用降血压肽4h和6h效果有显著差异；降血压肽在2~6h之内的降压效果具有显著性(P=0．05)，血压平均降低幅度为18～28mmHg。在6h处降压效果达到最大值为28mmHg，且效果极为显著(P=0．01)。第56页，课件共96页，创作于2023年2月抗肿瘤活性

第57页，课件共96页，创作于2023年2月

抗菌性

水生动物抗菌肽的研究主要集中于甲壳纲动物:1988年，从中国鲎血细胞用酸提取法得到一种含17个氨基酸的抗菌肽——鲎素，能与细菌细胞壁中的脂多糖成分结合形成复合物，在很低浓度下就能抑制G-及G+细菌的生长。鲎素在低pH、高温下相当稳定，是一种有应用前景的抗菌活性物质。1995年，从鲎体中分离得到一个79肽,与兔和牛的嗜中性白血球防御素相似;Noga等认为美洲蓝蟹的血细胞具有抗菌活性;Schnapp等从青缘蟹的血细胞中分离得到3种具有杀菌作用的肽,它们能够选择性地作用于细菌外层细胞膜的某些组分,如带阴离子的磷脂,增大其渗透性而杀死或抑制细菌的生长;第58页，课件共96页，创作于2023年2月Chisholm等研究包括龙虾和对虾在内的8种甲壳动物的血细胞溶泡上清液对数种细菌的杀菌作用,证明其含有能杀灭细菌的因子;Song等发现罗氏沼虾受感染后会诱导产生类似杀菌肽类的物质；Destoumieux等从养殖的南美白对虾的血细胞和血浆中分离出几种抗菌活性因子,其中3种具有抗真菌和抗细菌尤其是抗革兰阳性菌的活性。第59页，课件共96页，创作于2023年2月Azumi等从一种海鞘Halocyamineroretzi的血细胞中分离得到的抗菌肽HalocyamineA不仅在体外可抑制某些鱼RNA病毒的生长,也能抑制某些海水细菌的生长。Fernandes等从虹鳟鱼皮中分离得到一种具有抗菌作用的核蛋白肽,在抵御胞内或胞外病毒方面起着关键作用。第60页，课件共96页，创作于2023年2月最近的研究发现,鱼类中也存在大量的抗菌肽

Oren等从豹鳎中分离得到一种33肽的抗菌肽,具有比蜂毒素更强的抗菌活性,其作用可与其他天然的抗菌肽如蛙皮素、杀菌肽等相比;电镜观察显示其抑菌机理是溶解细菌的细胞壁。

Conlon等从海七鳃鳗的皮肤上分离得到富含半胱氨酸和精氨酸的多肽,其氨基酸序列与老鼠的抗菌肽corticostatinR4和兔的抗菌肽corticosta2tinR1结构相似。第61页，课件共96页，创作于2023年2月从软体动物贝类的血液中提取到2种富含阳离子与胱氨酸的抗菌小肽,其中1种含有34个氨基酸残基,命名为Mytilin,结构如下:Gly-Cys-Ala-Ser–Arg-Cys-Lys-Ala-Lys-Cys-Ala-Gly-Arg-Arg-Cys-Lys-Gly-Try-Ala-Ser-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-Arg-Cys-Tyr-Cys-Lys-Cys-Phe-Arg-Cys;

另一种含35～43个氨基酸残基,属于昆虫防御家族肽,与上述的Mytilin的结构相似,它富含8个胱氨酸，具有广谱抗细菌、抗真菌活性。第62页，课件共96页，创作于2023年2月牡蛎软体中抗菌蛋白的制备及活性研究材料：长牡蛎、大连湾牡蛎和近江牡蛎的肉菌株溶壁微球菌、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、金黄色葡萄球菌[JP-04-08、ATCC25922]、表皮葡萄球菌BP-04-18、大肠埃希氏菌[PC-04-21、ATCC25923]、铜绿假单胞菌[LN-04-12、ATCC27853]、变形杆菌BX-04-10、肺炎克雷伯杆菌、肠球菌、不动菌属。质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25922、大肠埃希氏菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853。文献阅读美国模式培养物保藏所中国生物制品检定所第63页，课件共96页，创作于2023年2月

方法1.抗菌蛋白的制备1.1粗蛋白的制备：取鲜活牡蛎5~10kg,以纯水冲洗后取牡蛎软体,洗净沥干约500g，经粉碎、低温研磨过100目筛,按重量比(w/w)1∶1加入注射用水,在1~4℃搅拌提取6~8h,匀浆液离心(4000r/min,40min),得蛋白粗提上清液。1.2液体浓缩蛋白的制备：将获得的粗提液采用SMB220生物型错流超滤系统分级(膜截留分子量为50kDa),再以截留分子量为10kDa的膜浓缩5倍。浓缩液密闭存放或制备成冻干粉。第64页，课件共96页，创作于2023年2月1.3蛋白的分离纯化：取超滤浓缩液2.0ml,上样于pH3.8柠檬酸-Na2HPO4缓冲液充分平衡后的CM-SepharoseFF层析柱(2.5cm×10cm)进行层析,用200ml含0-1.0mol/LNaCl的缓冲液进行线性梯度洗脱,收集活性峰,脱盐浓缩后，上样到以pH6.5NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液充分平衡的SephadexG-100层析柱(1.6cm×60cm)进行层析,用平衡液进行洗脱,收集活性峰,脱盐浓缩后－20℃保存备用。以上纯化操作均在4℃进行。第65页，课件共96页，创作于2023年2月2抗菌蛋白性质分析2.1纯度和分子量测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定：蛋白浓缩液(10μl,15μl)直接上样进行SDS分析,分离胶浓度为15％,电泳条件:电压200V,56min,用0.5％考马斯亮蓝R250染色,使用不同分子量的标准蛋白对抗菌蛋白进行分子量及其分布测试及分析。采用SDS方法测定：纯化蛋白测定，分离胶浓度为12%,用0.5%考马斯亮蓝R250染色。2.2含氮量测定取3批次(200305021、20030808、20040411)牡蛎海洋溶菌酶冻干粉按照中华人民共和国药典(2000年版二部)附录ⅦD氮测定法测定。第66页，课件共96页，创作于2023年2月3体外实验

3.1最低抑菌浓度（MIC)测定 采用平皿二倍稀释法和Denlay多点接种器进行药敏试验，试验菌用营养肉汤及脑心浸液增菌;抗菌蛋白海洋低温溶菌酶用水解酪蛋白琼脂(MH)肉汤二倍稀释成各种所需浓度,分别加适量至平皿中，MH培养基熔化后定量注入含药液平皿内混匀：生孢梭菌最终浓度为15×106cfu/ml,白色念珠菌18×106cfu/ml,其他菌液为1×105cfu/ml,需氧菌37℃培养18h,真菌20~25℃培养48h,厌氧菌置厌氧孵箱30~35℃孵育48h后观察结果,无菌生长的平皿中所含药物最小的浓度即为MIC。

3.2最低杀菌浓度MB测定 采用试管二倍稀释法,先测出试验菌的MIC,再依次将未见细菌生长各管培养液分别吸取0.1ml,转移到不含药液的琼脂平皿中,培养条件同MIC测定,观察测定结果,平皿上菌落数<5个的最小药物浓度即为MBC。第67页，课件共96页，创作于2023年2月4透射电镜观察抗菌蛋白对大肠埃希氏菌超微结构的变化试验以正常大肠埃希氏菌培养12h制备透射电镜样品作阴性对照组。以LB液体培养基将抗菌蛋白稀释成1.25mg/ml,加入对数生长期的大肠埃希氏菌,使浓度为1×105cfu/ml。摇床中培养(37min,200r/min)12h,离心弃上清,沉淀用磷酸缓冲液洗涤3次,制备透射电镜样品。固定、脱水、切片和染色后,作为实验组。透射电镜下观察大肠埃希氏菌超微结构的变化。第68页，课件共96页，创作于2023年2月

结果1抗菌蛋白的分离纯化抗菌蛋白经CM-SepharoseFF阳离子交换层析分离后,盐洗脱峰为活性峰,洗脱曲线见图1,收集活性峰浓缩后上样于SephadexG-100凝胶层析柱,洗脱曲线见图2,第二个峰为活性峰,收集活性峰透析浓缩后作为纯化样品使用。第69页，课件共96页，创作于2023年2月2抗菌蛋白性质分析2.1抗菌蛋白纯度和分子量测定由图a可见,牡蛎－海洋溶菌酶为含多种蛋白的混合物,其分子量分布较宽,从10KD一直到100kDa都有分布,其中分子量分布在15kDa和23kDa左右的组分含量较多。三批牡蛎－海洋溶菌酶浓缩液均为多种蛋白的混合物,其电泳条带相同,各条带的分布及浓度基本相同,说明样品制备的重现性良好,工艺稳定,产品质量稳定,见图b。

纯化样品为单一条带,由标准蛋白可知分子量约为39kDa。第70页，课件共96页，创作于2023年2月2.2含氮量测定

3批次抗菌蛋白冻干粉蛋白含量见表。第71页，课件共96页，创作于2023年2月2.3抗菌蛋白对生孢梭菌、白色念珠菌的抗菌作用抗菌蛋白对生孢梭菌最低抑菌浓度为0.0156%,最低杀菌浓度为0.0313%;对白色念珠菌最低抑菌浓度和最低杀菌浓度均为0.0625%第72页，课件共96页，创作于2023年2月2.4抗菌蛋白对临床常见致病菌和标准质控菌株的抗菌活性第73页，课件共96页，创作于2023年2月表明抗菌蛋白对临床常见的致病菌具有良好的抗菌作用且呈剂量依赖性对3株标准质控菌株也有较好的抗菌作用第74页，课件共96页，创作于2023年2月2.5抗菌蛋白对大肠杆菌超微结构的作用研究结果对照组:正常大肠杆菌形态为直杆状,细胞壁和细胞膜完整光滑,结构紧密,细胞膜紧贴细胞壁,细胞质均匀。抗菌蛋白(1.25mg/ml)组,大肠杆菌的形态发生改变,随时间的延长变化越来越明显:作用1h后,细胞壁松弛出现皱褶,菌体变短变粗,呈椭圆形,细胞质固缩;2h后,大部分菌体呈圆球形;3h后,菌体呈不规则形,细胞壁缺失,细胞质解体出现空腔,菌体裂解。第75页，课件共96页，创作于2023年2月

抗氧化性

Iwamoto等研究了鲭鱼肽对低密度脂蛋白(LDL)氧化的抑制作用。结果表明,鲭鱼肽能够显著延长氧化反应的诱导期。对16名平均年龄为19岁的女性志愿者进行了体内抗氧化实验。对照期内食用含酪蛋白的食物,实验期内食用含鲭鱼肽的食物,剂量按16.9g蛋白/d,共10d。其他膳食组分同。提取静脉血试样测定LDL的氧化情况，结果表明,试验组第10d时静脉血试样LDL氧化的诱导期(66.2min)比0d时静脉血试样LDL氧化的诱导期(57.9min)长,而对照组在0d和10d的静脉血试样LDL氧化的诱导期之间不存在差异。第76页，课件共96页，创作于2023年2月KimSe-Kwon等报道,黄鳍舌鳎鱼皮胶原酶解得到的多肽也具有较好的抗氧化活性。采用现代生物工程技术,从栉孔扇贝中提取的海洋多肽,相对分子质量为800～1000,经药理试验表明,具有抗氧化损伤作用,能清除超氧负离子和羟自由基,延缓皮肤老化,可显著增强免疫细胞的代谢和增殖,是一种有潜力的抗氧化剂和免疫细胞调节剂。第77页，课件共96页，创作于2023年2月发酵法制备鱼鳔多肽及其抗氧化活性研究文献阅读1.材料与方法1.1材料、试剂与仪器鳙鱼鱼鳔水产批发市场；其他试剂均为分析纯。SorvallEvolutionRC728411型冷冻离心机美国热电公司；超滤设备及超滤膜美国Millipower公司；Lambada25型可见紫外检测仪美国PE公司；DS-1高速组织捣碎机。1.2菌种及培养基米曲霉(Aspergillusoryzae)中国工业微生物菌种保藏中心(CICC40186)种子培养基(PDA)：马铃薯汁1000ml，葡萄糖20g，自然pH值。第78页，课件共96页，创作于2023年2月1.3方法1.3.1鱼鳔预处理鱼鳔用离子水浸泡漂洗，按每100g鱼鳔加100ml去离子水进行均浆，匀浆液稀释到蛋白浓度5%(m/V)后进行巴氏灭菌(60℃，30min)，备用。1.3.2发酵菌种的制备从活化的菌种保藏斜面中挑取两环接种于种子培养基中，28℃、120r/min培养36h，使菌体浓度达到106CFU/ml。1.3.3鱼鳔匀浆液发酵按5%(V/V)将发酵菌株液接种于鱼鳔匀浆液28℃、120r/min培养，于不同发酵时间取样。发酵液于4℃10000r/min离心30min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液为鱼鳔多肽混合液，冷冻干燥，得鱼鳔多肽粗粉，冷冻保藏备用。第79页，课件共96页，创作于2023年2月1.3.4超滤分离用去离子水将发酵液配成10mg/ml的样液，分别通过截留分子量为10、3、1kD的超滤膜进行超滤，收集不同截留分子量的滤液，分别编号为肽Ⅰ(Mw≤1kD)、肽Ⅱ(1kD≤Mw≤3kD)、肽Ⅲ(3kD≤Mw≤10kD)1.3.5测定方法多肽含量的测定采用以酸可溶性多肽计，将等体积的0.4mol/L三氯乙酸(TCA)加入到多肽混合液中，静置0.5h后10000r/min离心10min，去除酸不溶性的蛋白和长链肽沉淀，用双缩脲法测定上清液中的多肽含量；测定发酵液水解度和平均肽链长度。清除O2-·能力测定采用NBT法；清除·OH能力测定采用D-2-脱氧核糖法；抗氧化力测定采用亚油酸自氧化法。第80页，课件共96页，创作于2023年2月2结果与分析2.1发酵过程中鱼鳔蛋白水解动态第81页，课件共96页，创作于2023年2月配制多肽液浓度为10mg/ml，测定自由基清除能力和抗氧化能力。2.2鱼鳔发酵液的抗氧化活性发酵时间40h，水解度为22%时，所得鱼鳔肽的抗氧化力最强。第82页，课件共96页，创作于2023年2月鱼鳔多肽液经不同截留分子量的超滤膜超滤后，各片段滤液配成质量浓度为10mg/ml的多肽液，分别测定其自由基清除能力和抗氧化能力。2.2超滤液的抗氧化活性由5～12个氨基酸残基组成片段具有较强抗氧化性第83页，课件共96页，创作于2023年2月利用微生物在发酵过程中所产的蛋白酶水解鱼鳔蛋白：鱼鳔营养成分全面丰富，良好的生长培养基；高含量的鱼鳔蛋白可被微生物酶水解，通过控制发酵时间，便可制备出链长适当，具有一定生理活性的鱼鳔多肽。显而易见，其生产成本低廉，因而十分适于工业化生产。O2·和·OH等活性氧自由基诱导的氧化损伤一直被认为是引起衰老、细胞损伤和癌变的原因之一，鱼鳔肽富含供氢体，可使具有高度氧化性的自由基还原，从而能终止自由基连锁反应。微生物发酵法尚存在一些不足，主要表现在发酵时间过长，肽链长度分布范围较广，后续分离纯化的困难。3讨论第84页，课件共96页，创作于2023年2月深化研究的方向对微生物发酵工艺进行优化，缩短发酵时间；控制好水解度(发酵程度)，建立不同发酵时间与分子量分布的关系；对鱼鳔多肽的体内抗氧化效果及其他的生理活性进行研究；对制备所得鱼鳔多肽中具有显著生物活性的肽段序列进行测序，揭示结构和活性之间的构效关系。第85页，课件共96页，创作于2023年2月这类肽可作为肠道营养剂或以流质食物形式提供给处于特殊年龄或特殊身体状况下的人(如消化能力不健全的新生儿,消化能力退化的老年人;经过手术特别是消化道手术后的康复者或有待于治疗的病人;由于过度疲劳、生活没有规律而胃肠功能下降者;还有对蛋白质抗原性过敏的过敏性体质者等)。易消化功能肽不仅能提供丰富的必需氨基酸,还能促进双歧杆菌的生长繁殖,促进乳酸杆菌的生长发育,有望在酸奶、面包、乳酪中提高营养价值,改善风味和品质。

易消化吸收

第86页，课件共96页，创作于2023年2月几个思考（1）将陆地酶工程技术应用于海洋蛋白酶解活性肽的研究,在此基础上,开发海洋蛋白资源酶解专用工程用酶。将陆地微生物发酵工程和酶工程技术应用于海洋蛋白资源的综合利用研究,以海洋生物蛋白资源为原料,通过生物酶解、提取、加工,可生产许多酶解陆地蛋白源和化学合成所无法生产的产品和材料,研制出系列天然、高效、新颖的生物活性肽。第87页，课件共96页，创作于2023年2月（2）大力加强用于海洋蛋白源酶解的专用蛋白酶制剂的开发由于陆地生态环境、淡水生态环境与海洋生态环境具有很大的差异,海洋生物为了适应所处的特殊的生态环境,其氨基酸的组成和氨基酸的序列肯定与陆地及淡水生物的蛋白源具有很大的差别。目前进入工业生产的蛋白酶制剂可能无法高效用于海洋蛋白源的酶解。因此,应从海洋生物体内、海水及海洋污泥中分离、纯化可高