D101树脂分离纯化香椿叶中有效成分研究

PAGE毕业论文D101树脂分离纯化香椿叶中有效成分研究PAGEIV毕业论文任务书论文题目：D101树脂分离纯化香椿叶中有效成分研究系部：化学与化工系专业：制药工程学号：学生：指导教师（含职称）：1.课题意义及目标黄酮类化合物是一类低分子天然植物成分，广泛存在于高等植物细胞中，其主要作用有：抗肿瘤、延缓衰老、增强心血管功能、增强免疫力。香椿叶中含有一定量的黄酮类物质。本课题采用D101树脂对香椿叶提取物进行分离纯化研究，确定适宜的分离纯化条件。为生产工业化提供技术支持。2.主要任务（1）树脂预处理（2）样品预处理（3）黄酮测定方法（4）考虑静态吸附实验的影响因素（5）动态吸附、脱附实验的影响因素3.主要参考资料[1]王秋安.天然黄酮类化合物的生理功能及其应用[J].香料香精化妆品,1999,(3):28-33.[2]郑亚杰.大孔吸附树脂分离纯化山楂叶中黄酮的研究[J].华中科技大学学报(医学报)2004,33(2):136-138.[3]陈乃富,张莉.蕨菜黄酮类化合物的提取与分析[J].中国林副特产,2004,(6):1-4.4.进度安排论文各阶段名称起止日期1查阅相关资料并完成开题报告2015年12月15日~2016年03月05日2详细设计实验过程，实验仪器和药品准备2016年03月06日~2016年03月16日3试验研究2016年03月17日~2016年05月20日4分析实验数据，得出结果，着手撰写毕业论文2016年05月21日~2016年06月05日5修改毕业论文，定稿，答辩2016年06月06日~2016年06月22日审核人：年月日D101树脂分离纯化香椿叶中有效成分研究摘要香椿叶中的有效成分：黄酮类化合物，具有药理作用。为实现香椿叶中黄酮的分离纯化，用D101型大孔树脂对香椿中的黄酮分离纯化，分析D101型大孔树脂对黄酮类化合物吸附率和解吸率的主要影响因素。从静态、动态两个方面考察了时间、上样液量、pH、洗脱液用量、洗脱液的pH、乙醇体积分数及流速对D101型大孔树脂对静态吸附、解吸和动态吸附、解吸的影响。结果得出，D101型大孔树脂对香椿叶中黄酮类化合物的最佳吸附条件为：上样液量为40mL，流速为1mL/min，pH为4，吸附率可达到38.06%。乙醇对吸附饱和的D101型大孔树脂的最佳解吸条件为：40mL70%的洗脱液，流速为1mL/min，乙醇体积分数为70%，pH为2，解吸率可达到52.87%。关键词：香椿叶；黄酮类化合物；D101树脂；吸附；解吸

D101ResinPurificationCedrelaSinensisLeavesintheStudyofEffectiveIngredientsAbstractTheflavonoidssubstances

intheCedrelasinensisleaves,havepharmacologicaleffects.Torealizetheseparationandpurificationof

yellowintheketonecedarleaf,usingD101macroporousresinsforisolationandpurificationofflavonoidsincedar.Toanalysisthemaininfluencingfactorsthatinfluence

D101macroporousresinadsorptionanddesorptionrate.Fromtwoaspectsofthestaticanddynamicexperimentshowthe

time,amountofsampleliquid,pH,thedosageofeluentethanol,PHoftheeluent,ethanolvolumefractionandthevelocityinfluenceD101macroporousresinonthestaticadsorptionanddesorptionexperimentsandtheinfluenceofdynamicadsorptionanddesorptionexperiments.Resultsobtained

theoptimumadsorptionconditionsthatD101macroporousresinforflavonoidssubstancesinthe

cedrelasinensisleaves

areasfollows：thesampleliquidvolumeis40mL,flowrateof1mL/min,pHof4,adsorptionratecanreach38.06%.ethanolontheadsorptionsaturationD101macroporousresinbestdesorptionconditionis:40mL70%ofeluent,flowrateof1mL/min,ethanolvolumefractionis95%,pHof2,desorptionratecanreach52.87%.Keywords:Cedrelasinensisleaves;Flavonoids;D101resin;Adsorption;Desorption目录1绪论 11.1前言 11.2香椿叶的分布分类 11.3香椿叶的化学成分 11.3.1黄酮类化合物 21.3.2萜类化合物 21.4分离纯化方法 21.4.1酶解法 21.4.2超临界萃取法 21.4.3大孔树脂吸附法 31.5本课题研究背景及意义 31.6本课题的研究目的及主要内容 41.6.1研究目的 41.6.2研究内容 42实验部分 52.1实验仪器与材料药品 52.1.1实验仪器 52.1.2材料药品 52.2黄酮类化合物含量测定方法 62.3工艺流程 62.3.1静态吸附、解吸示意图 62.3.2动态吸附、解吸示意图 62.3.3样品溶液的制备 72.3.4芦丁标准曲线的绘制[14-15] 72.3.5树脂预处理及装柱 72.4D101树脂对黄酮类化合物的静态吸附、解吸实验 82.4.1吸附时间对吸附效果的影响 82.4.2上样液量对吸附效果的影响 82.4.3上样液pH对吸附效果的影响 82.4.4解吸时间对解吸效果的影响 92.4.5洗脱液量对解吸效果的影响 92.4.6洗脱液pH对解吸效果的影响 92.4.7洗脱液浓度对解吸效果的影响 102.5D101树脂对黄酮类物质的动态吸附、解吸实验 102.5.1上样液量对吸附效果的影响 102.5.2上样流速对吸附效果的影响 102.5.3洗脱流速对解吸效果的影响 102.6正交试验 102.7香椿叶中黄铜类化合物的薄层色谱分析 112.7.1芦丁标准品溶液的配制 112.7.2槲皮素标准品的配制 122.7.3薄层色谱法鉴别香椿叶提取液中的芦丁 122.7.4薄层色谱法鉴别香椿叶提取液中的槲皮素 123结果与讨论 133.1芦丁标准曲线的绘制 133.2D101树脂对黄酮类物质的静态吸附、解吸分析 133.2.1吸附时间对吸附效果的影响 133.2.2上样液量对吸附效果的影响 153.2.3上样液pH对吸附效果的影响 163.2.4解吸时间对解吸效果的影响 163.2.5洗脱液量对解吸效果的影响 183.2.6洗脱液pH对解吸效果的影响 183.2.7洗脱液浓度对解吸效果的影响 193.3D101型大孔树脂对黄酮物质的动态吸附、解吸分析 203.3.1上样液量对吸附效果的影响 203.3.2上样液流速对吸附效果的影响 213.3.3洗脱流速对解吸效果的影响 213.4正交实验 223.4.1正交吸附实验 223.4.2正交解吸实验 233.5香椿叶中黄酮类化合物的薄层色谱分析结果 243.5.1薄层色谱法鉴别香椿叶提取液中的芦丁 243.5.2薄层色谱法鉴别香椿叶提取液中的槲皮素 244结论 25参考文献 26致谢 271绪论1.1前言香椿，又指香椿芽，被称为“树上蔬菜”，具有食疗作用。国内外对香椿的研究主要体现在其抗肿瘤、降血糖等众多药理功效。黄酮类化合物的主要作用有：对肿瘤的抑制作用、抑制细胞衰老，使人保持年轻、对心脑血管疾病有一定的功效、增强人类抵抗疾病的能力。特别是具有抗自由基及抗癌、防癌的作用。因此，黄酮的提取制备技术具有重要的经济和实用价值[1]。国内外对香椿的研究主要体现在其抗肿瘤、降血糖等众多药理功效。本实验采用微波萃取的方法得到香椿叶黄酮粗提液。通过考察D101型大孔树脂的吸附率和解吸率，研究D101大孔树脂对香椿叶粗提液中有效成分的吸附和解吸效果，通过静态吸附、解吸实验及动态吸附、解吸实验对香椿叶中黄酮的分离纯化工艺条件进行探究，确定最佳的工艺条件。1.2香椿叶的分布分类香椿叶中含有多种生物活性物质，主要有黄酮、生物碱、萜类、甾体、皂甙、多酚类化合物以及挥发油等，具有较高的药用与保健价值[2]。香椿在我国分布广泛，栽培历史悠久距今至少有2300年的历史[3]，最初栽培的目的是取牙作为菜食用，多种植于村边路旁。香椿原产于中国，分布于我国华北、华南和西南各省，其中山东、河南、河北等省栽培较多。世界上约有15种，分布于大洋洲和亚洲[4]。1.3香椿叶的化学成分香椿叶中含有多种化学成分。陈铁山[5]等利用系统预试法对香椿种子、枝叶中主要的化学成分以及提取的种子挥发油进行初步的定性检验。结果显示，香椿叶中含有醛、酮、萜类、皂类、甾体、硫醇类化合物、多元醇类化合物、芳香族类化合物和叔醇类化合物等。张仲平[6]化学成分预测法发现香椿叶中含有丰富的小分子鞣质、原花色苷、黄酮醇苷、皂苷、有机酸等，利用薄层色谱分析（TLC）得到香椿叶经水解后苷元主要是槲皮素、山奈酚；多酚中含黄酮类苷和苷元、没食子酸、没食子儿茶素缩合鞣质、没食子鞣质、单体原花青素等成分。1.3.1黄酮类化合物黄酮类化合物又称黄酮体、黄碱素，是植物界中存在十分广泛的一大类天然化合物，属于植物的次级代谢产物，存在于所有维管植物的叶、根、茎、花和果实之中[7]。黄酮类化合物按分子的结构[8]大致可以分为单黄酮类化合物、双黄酮类化合物和儿茶素类化合物，都具有多种生物活性功能，如抗病毒、抗氧化、抗菌、抗癌症、抑制高血压、抗衰老、预防心血管疾病、高血脂等。1.3.2萜类化合物萜类物质具有明显的抗病杀菌作用，是香椿叶中有效成分的一种。从结构上可划分为若干个异戊二烯单位，称为异戊二烯规则。在植物体内萜类的真正前提是由乙稀生成的甲戊二羟酸，称为生源的的异戊二烯规则[9]。1.4分离纯化方法1.4.1酶解法酶是催化剂的一种，具有高效性、专一性。酶解法是利用纤维素酶对样品物质进行适当的处理，破坏样品物质的细胞壁，使样品物质的细胞壁结构得到破坏,降低操作难度，这种方法体现了酶的专一性，利用了酶的特异性，这也是酶解法的原理。1.4.2超临界萃取法超临界萃取的特性：流体的状态接近临界区，在临界点操作更有利于传热和节能。超临界萃取的特点：具有耗能低、速度快、效率高的特点。主要的缺点如下：以超临界CO2为例，由于其操作过程是在高压条件下进行的，设备投资高、风险性高；适用范围有限，此方法主要适用于高附加值、热敏性物质的分离。1.4.3大孔树脂吸附法大孔吸附树脂纯化是一项不需要复杂设备、操作条件温和的新型分离技术[10].具有吸附快、吸附容量大、吸附选择性好、解吸条件温和、洗脱率高、物化稳定性高、不受无机物存在的影响、再生简单、使用周期长、易于构成闭路循环、节省费用等优点，适宜工业化生产[11]本实验采用D101型大孔树脂进行分离纯化。（1）D101树脂吸附机理D101树脂吸附是一个复杂的非均相液固反应。吸附包括3个过程[12]：第一为颗粒外部扩散，被吸附物质由溶液主体向吸附剂表面扩散；第二为孔扩散过程，被吸附物质从颗粒孔道中向吸附点扩散；第三为内表面吸附过程，物质被吸附在吸附剂颗粒内表面上。即表现为不同的吸附时间后，吸附遵循不同的规律。（2）吸附法分离过程吸附法分离过程的原理是利用吸附剂与混合物中不同组分间结合力的不同而达到分离效果。吸附过程中分子间的作用力在固体内部是对称的，而在固体表面是不对称的，因而当气体分子或溶液中溶质分子在碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面[13]。1.5本课题研究背景及意义我国拥有丰富的香椿资源。目前，香醇的种植广泛，其中山东、河南、河北种植较广。目前，使用溶剂对香椿叶中的有效成分进行提取，此法存在一定的不足之处。例如：所得产物的纯度低、溶剂有残留。近期出现的酶提取法、超声波、微波提取法以及超临界提取法，虽然提取率提高了，但操作成本也提高了。所以在提取的基础上，采用树脂进行分离纯化不仅能大大提高香椿叶提取物的黄酮含量，而且操作简单，成本低，应用前景广。大孔树脂虽然在分离以及提纯方面具有一定的优势，但它的应用还在探索中。通过这些研究，有利于优化生产工艺，提高分离效果，高效利用资源，推进了吸附纯化法制备中药制剂的进程。1.6本课题的研究目的及主要内容1.6.1研究目的本课题是通过研究D101型大孔树脂对香椿叶中黄酮类化合物的吸附率和解吸率为指标，考察D101型大孔树脂的吸附与解吸能力，确定D101型大孔树脂分离纯化香椿叶中有效成分（黄酮类化合物）的最佳纯化工艺条件。1.6.2研究内容（1）树脂预处理以及样品预处理（2）静态吸附试验①吸附时间对吸附效果的影响②上样液量对吸附效果的影响③上样液pH对吸附效果的影响（3）静态解吸试验①解吸时间对解吸效果的影响②洗脱液量对解吸效果的影响③洗脱液pH对解吸效果的影响④洗脱液浓度对解吸效果的影响（4）正交试验2实验部分2.1实验仪器与材料药品2.1.1实验仪器XH-100A微波催化合成萃取仪（北京详鹄科技发展有限公司）恒温水浴锅（北京医疗设备厂）予华牌循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）722N可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）JA2003M电子天平（上海精密科学仪器有限公司）微型植物试样粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）PHB-4便携式pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）恒温振荡仪（国华企业）2.1.2材料药品香椿叶（山西省太原市）95%乙醇（天津市北辰方正化学试剂厂）氢氧化钠（天津市大茂化学试剂厂）浓盐酸（西陇化工股份有限公司）硝酸铝（天津市大茂化学试剂厂）亚硝酸钠（天津市大茂化学试剂厂）D101型大孔树脂（山东东鸿化工有限公司）芦丁标准品（中国药品生物制剂鉴定所）槲皮素标准品（中国药品生物制剂鉴定所）D101大孔树脂的物性参数 外观：乳白色不透明球状颗粒粒径范围：（0.3～1.25）mm≥90%（60～16目）含水量：65～75%比表面积：m2/g≥400，比照吸附量mg/g（酚/干基）≥30堆积密度：g/mL0.65～0.7（湿态）2.2黄酮类化合物含量测定方法国内外香椿叶黄酮含量分析方法有分光光度法、气相色谱法、高效液相法色谱法、荧光法。本实验采用分光光度法，因为分光光度法具有应用广泛，灵敏度高，选择性好，准确度高，适用浓度范围广，分析成本低，操作简便、快速的特点。具体实验步骤为：准确量取样品溶液2.5mL于25mL容量瓶中，加入5%的亚硝酸钠溶液0.75mL，摇匀，放置6min后加入10%的硝酸铝溶液0.75mL，摇匀，放置6min后加入4%氢氧化钠溶液10.0mL，用60%乙醇定容，摇匀，放置15min后于510nm处测定吸光度，根据标准曲线计算黄酮浓度。2.3工艺流程2.3.1静态吸附、解吸示意图微波处理恒温浸提滤液残渣过滤 70%乙醇微波处理恒温浸提滤液残渣过滤香椿叶香椿叶收集树脂收集树脂测定黄酮含量洗脱树脂吸附70%乙醇测定黄酮含量洗脱树脂吸附解吸液解吸液2.3.2动态吸附、解吸示意图微波处理恒温浸提过滤香椿叶70%乙醇滤渣微波处理恒温浸提过滤香椿叶滤液滤液树脂预处理装柱树脂预处理装柱收集树脂收集树脂测定黄酮含量洗脱树脂吸附测定黄酮含量洗脱树脂吸附解吸液70%乙醇解吸液2.3.3样品溶液的制备将晾干后的香椿叶进行粉碎。称取10g香椿叶粉末，以50%的乙醇溶液作溶剂，按料液比为1:40加入40%的乙醇400mL，放入微波萃取仪中，在500W，70℃，一定的转速下提取15min，取出后进行抽滤得到滤液，备用。2.3.4芦丁标准曲线的绘制[14-15]用分光光度计测量吸光度值并绘制标准曲线。准确称取0.02g芦丁标准品用60%的乙醇溶解，定容到100mL容量瓶中，摇匀，得0.2mg/mL的芦丁标准溶液。分别移取0.0mL，1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL，5.0mL的芦丁标准溶液于0，1，2，3，4，5号25mL容量瓶中，各加5%的亚硝酸钠溶液0.75mL，摇匀，放置6min后加入10%的硝酸铝溶液0.75mL，摇匀，放置6min后加入4%的氢氧化钠溶液10.0mL，用60%的乙醇溶液定容，摇匀，放置15min后用空白试剂做参比，在510nm处测定吸光度A。2.3.5树脂预处理及装柱（1）取适量的量的D101型大孔树脂，用去离子水浸泡数小时，待其充分溶胀后进行抽滤。（2）用5%盐酸溶液浸泡24h，并充分搅拌，24h后用去离子水将树脂洗至中性，进行抽滤。（3）用2%的氢氧化钠溶液浸泡24h，24h后用去离子水将树脂洗至中性，进行抽滤，去除水分。（4）用95%乙醇溶液浸泡24h，用去离子水将树脂上的乙醇洗净，室温条件下干燥，将干燥的树脂密封留以备用。将预处理过的D101型大孔树脂进行湿法装柱。装柱前向柱内加入一定量的95%的乙醇，同时将树脂沿玻璃棒一次性匀速加入层析柱中，同时打开柱底活塞，进行排气。装柱过程中始终保持液体高出树脂层面20厘米以上，防止液体流干。2.4D101树脂对黄酮类化合物的静态吸附、解吸实验2.4.1吸附时间对吸附效果的影响研究随吸附时间的增长，D101树脂对样品溶液吸附率的变化趋势。准确称取1.0gD101树脂于100mL锥形瓶中，加入样品溶液40mL，放入恒温振荡仪中，调节转速为110r/min，温度调节为30℃，每隔1h吸取1mL溶液于10mL容量瓶中，进行显色反应，利用分光光度仪测定黄酮浓度。时间作为横坐标，吸附率为纵坐标，绘制静态吸附动力学曲线。Q～吸附量，mg/g；C0～原液中黄酮浓度，mg/mL；C1～吸附液中黄酮浓度，mg/mL；C2～解吸液中黄酮浓度，mg/mL；V～吸附溶液体积，mL；A～吸附率；B～解吸率。2.4.2上样液量对吸附效果的影响（1）称取1.0g预处理过的D101树脂四份，并放到4个100mL具塞锥形瓶中。（2）分别向四个锥形瓶中加入20mL，30mL，40mL，50mL样品溶液，并标号为1，2，3，4。（3）将4个锥形瓶放入恒温振荡仪振荡24h，振荡参数为110r/min，30℃。（4）经过24h的吸附过程后，把4个锥形瓶取出，在1号锥形瓶中取1mL溶液放入10mL容量瓶中，进行显色反应，测定其黄酮浓度。（5）其他样品溶液操作步骤同上，并绘制吸附曲线。2.4.3上样液pH对吸附效果的影响（1）准确称取1.0g预处理过的D101树脂4份，分别放入4个100mL具塞锥形瓶中。（2）量取样品溶液4份（40mL/份），分别用5%的盐酸和2%的氢氧化钠溶液调节pH为2，3，4，5。（3）将调节好的样品溶液分别倒入1，2，3，4号锥形瓶中，并放入恒温振荡仪振荡24h。（4）经过24h的吸附过程后，把4个锥形瓶取出，在1号锥形瓶中取1mL溶液放入10mL容量瓶中，进行显色反应，测定其黄酮浓度。（5）其他样品溶液操作步骤同上，并绘制吸附曲线。2.4.4解吸时间对解吸效果的影响（1）将饱和的D101型大孔树脂及剩余的样品溶液进行抽滤，并用去离子水洗至无色。（2）将抽滤后的树脂移入100mL具塞容量瓶中，加入70%的乙醇40mL，放入恒温振荡仪中解吸，振荡参数为110r/min，30℃。（3）每隔一定时间吸取1mL上层液于25mL容量瓶中，进行显色反应。（4）利用分光光度仪测定黄酮浓度，计算解吸率。（5）以时间为横坐标，解吸率为纵坐标，绘制解吸曲线。2.4.5洗脱液量对解吸效果的影响（1）称取4份吸附饱和的1.0gD101树脂。分别放入4个100mL具塞锥形瓶中，标号为1，2，3，4。（2）分别加入20mL，30mL，40mL，50mL70%的乙醇溶液。（3）将1，2，3，4，号锥形瓶放入恒温振荡仪振荡24h，进行解吸。（4）24h后将4个锥形瓶取出，分别取1mL于4个10mL容量瓶中，测其吸光度，从而计算黄酮浓度，得出树脂的解吸率。2.4.6洗脱液pH对解吸效果的影响称取吸附饱和的D101树脂各1.0g于4个100mL具塞容量瓶中，量取70%的乙醇4份（40mL/份），分别用5%的盐酸和2%的氢氧化钠溶液调节乙醇溶液pH为2，3，4，5，将调节好pH的乙醇溶液分别倒入1，2，3，4号锥形瓶中，并放入恒温振荡仪中解吸24h，振荡参数：30℃，转速110r/min，24h后分别测四个锥形瓶中溶液的吸光度，从而计算黄酮浓度，求得D101型大孔树脂的解吸率。2.4.7洗脱液浓度对解吸效果的影响称取吸附饱和的D101树脂各1.0g于4个100mL具塞容量瓶中，分别加入60%，70%，80%，95%的乙醇溶液。将4个锥形瓶放入恒温振荡仪中振荡24h。分别取1mL于4个10mL容量瓶中，测其吸光度，从而计算黄酮浓度，得出树脂的解吸率。2.5D101树脂对黄酮类物质的动态吸附、解吸实验2.5.1上样液量对吸附效果的影响准确称取1.0gD101树脂，将称好的D101树脂装柱，将柱中95%的乙醇流出，加入一定量pH为4的样品溶液，调节流速为1mL/min，每隔5mL收集一次流出液，从流出液中取出1mL于10mL容量瓶中，测定黄酮浓度，计算吸附率。以上样液体积为横坐标，吸附率作为纵坐标，绘制曲线。2.5.2上样流速对吸附效果的影响准确称取1.0gD101树脂，将称好的树脂装柱，取40mL提取液倒入柱中，调节流速为1mL/min，收集流出液。待流出液全部流出后，取1mL流出液于10mL容量瓶，测定黄酮浓度。重复上述步骤，一次调节流速为1mL/min，2mL/min，3mL/min，4mL/min，收集流出液，取1mL流出液于10mL容量瓶，测定黄酮浓度，分别计算树脂的吸附率。2.5.3洗脱流速对解吸效果的影响将已吸附饱和的D101型大孔树脂，用去离子水将大孔树脂清洗至溶液变为无色，用40mL70%的乙醇以2mL/min的流速对树脂进行解吸，收集解吸液。待解吸液全部流出后，取1mL于10mL容量瓶中，测定黄酮浓度。重复上述步骤，依次用70%的乙醇以1mL/min，2mL/min，3mL/min，4mL/min的流速解吸，收集流出液，取1mL流出液于10mL容量瓶，测定黄酮浓度，分别计算树脂的解吸率。2.6正交试验表2.1L4（23）吸附因素与水平表因素名称A吸附流速（mL/min）B吸附pH上样液量（mL）水平11330水平22440表2.2L4（23）吸附正交表编号吸附流速（mL/min）吸附pH上样液量（mL）11330214403234042430表2.3L4（23）解吸因素与水平表因素名称解吸流速(mL/min)解吸pH解吸液浓度(mg/mL)水平11270%水平22380%表2.4L4(23)解吸正交表编号解吸流速（mL/min）解吸pH解吸液浓度（%）11270%21380%32280%42370%根据上述表格条件进行正交实验，得出最佳工艺条件。2.7香椿叶中黄铜类化合物的薄层色谱分析2.7.1芦丁标准品溶液的配制精确称量芦丁标准品10.00mg放入小烧杯中，加入适量的60%的乙醇溶液并不断地搅拌使其完全溶解，用玻璃棒将其移至10mL的容量瓶中，用60%的乙醇溶液定容至刻度。得到质量浓度为1.00mg/mL的标准品溶液，放置到冰箱中保存。2.7.2槲皮素标准品的配制精确称量槲皮素标准品35.00mg放入小烧杯中，加入适量的60%的乙醇溶液并不断地搅拌使其完全溶解，用玻璃棒将其移至10mL的容量瓶中，用60%的乙醇溶液定容至刻度。得到质量浓度为3.5mg/mL的标准品溶液，放置于冰箱内保存。2.7.3薄层色谱法鉴别香椿叶提取液中的芦丁（1）在距离硅胶板底边2cm处用铅笔划一条细线，并确定点样点。（2）用毛细管吸取芦丁标准溶液2μL；吸取未酸解的供试品溶液10μL，在同一块硅胶板上进行点样。（3）先将展开剂（正丁醇：冰醋酸：蒸馏水为4:1:1）放入展开缸，然后将已点样的硅胶板放入展开缸内进行展开。（4）最后将硅胶板取出并吹干，在紫外灯下进行检视（254nm）。2.7.4薄层色谱法鉴别香椿叶提取液中的槲皮素（1）在距离硅胶板底边2cm处用铅笔划一条细线，并确定点样点。（2）用毛细管吸取槲皮素标准溶液2μL；吸取酸解的供试品溶液10μL，在同一块硅胶板上进行点样。（3）先将展开剂（苯：乙酸乙酯：甲酸为9:4:1）放入展开缸中，然后将已点样的硅胶板放入展开缸内进行展开。（4）最后将硅胶板取出并吹干，在紫外灯下进行检视（254nm）3结果与讨论3.1芦丁标准曲线的绘制表3.1芦丁标准曲线编号黄酮浓度（mg/mL）吸光度A00.0000.00010.0080.11220.0160.21130.0240.30940.0320.40150.0400.511图3.1芦丁标准曲线回归曲线方程：，R2=0.9992，有较好的线性关系，可作为标准曲线。3.2D101树脂对黄酮类物质的静态吸附、解吸分析3.2.1吸附时间对吸附效果的影响计算实例：A0=0.255，A1=0.1285，代入标准曲线求得C0=0.1986mg/mL，C1=0.09753mg/mL。吸附率：表3.2吸附时间对吸附效果的影响时间吸光度A吸附液黄酮浓度（mg/mL）吸附率（%）00.25550.19860.0010.12850.097550.8820.12200.092453.4930.11700.088455.4940.11350.085656.8950.10900.082058.6960.10650.078060.7070.10400.077660.9080.10350.076861.3090.10250.077261.10100.10300.077660.90110.10350.076861.30120.10300.077660.90图3.2吸附时间对吸附效果的影响从图3.2可知，D101型大孔树脂对香椿叶中黄酮类化合物的静态吸附为快速平衡型。D101型大孔树脂的吸附率随着时间的延长逐渐递增，在某一时刻后趋于平衡。吸附过程刚开始时，树脂的吸附率随时间的延长增长较快，时间与吸附率几乎成正比关系，随后增长趋势减小。可见吸附过程刚开始时，吸附效果相对来说比较明显，在吸附时间达到8小时后增长速度趋于平衡。由此可得，D101型大孔树脂对黄酮类化合物的静态吸附时间至少8小时，即D101大孔树脂达到吸附饱和至少需要8小时。3.2.2上样液量对吸附效果的影响表3.3上样液量对吸附效果的影响上样液量（mL）吸光度A 吸附液黄酮浓度（mg/mL）吸附率（%）200.1860.143327.84300.17550.134932.05400.15750.120636.26500.17750.136531.25图3.3上样液量对吸附效果的影响由图3.3可知，上样液量增加，D101型大孔树脂的吸附率先增加后减小，在40mL左右吸附率达到最大值。上样液量为20mL、30mL时吸附率相对较小，可能是因为吸附未达到饱和的原因；解析率的值在上样液量为40mL达到最大值，当上样液量为50mL时吸附率反而降低，可能是由于D101型大孔树脂的选择性降低。因此，本实验选取适宜的上样液量范围为30mL～40mL左右。3.2.3上样液pH对吸附效果的影响表3.4pH对吸附效果的影响pH吸光度A吸附液黄酮浓度（mg/mL）吸附率（%）20.17350.133332.8530.17000.130534.2540.15300.117041.0750.16500.126636.26图3.4pH对吸附效果的影响由图3.4可见，D101大孔树脂随样品溶液pH的增大吸附率逐渐增加，在pH为4左右达到最大，而后有所减小。由此可见，采用D101型大孔树脂吸附香椿叶中黄酮类化合物时，将样品溶液调至酸性条件有利于吸附。由图可知，在pH为3～4时吸附率最大，故适宜的pH为3～4。3.2.4解吸时间对解吸效果的影响表3.5解吸时间对解吸效果的影响时间（h）吸光度A解吸液黄酮浓度（mg/mL）解吸率（%）00.00000.0000.0010.04550.031525.9720.05700.040633.5130.05850.041834.4940.06550.047442.5650.07050.051442.3660.07100.051842.6970.07350.053844.3380.07400.054244.6690.07300.053444.00100.07400.054244.66110.07400.054244.66图3.5解吸时间对解吸效果的影响由图3.5可以看出，洗脱剂对饱和的D101型大孔树脂的静态解吸过程也为快速平衡型，总体趋势为随时间的增长，解吸率先增长后趋于平衡。吸附时间未达到4h时，时间与吸附率几乎成正比关系，且斜线的斜率很大，即树脂的脱附效果明显。当解吸时间达到7小时，解吸率的大小几乎不再变化，由此得出，D101树脂的静态解吸时间最少需要7小时。3.2.5洗脱液量对解吸效果的影响表3.6不同量的乙醇对解吸效果的影响洗脱液量（mL）吸光度A解吸液黄酮浓度（mg/mL）解吸率（%）200.03000.019234.68300.03700.024738.88400.04900.034347.22500.04600.031940.912图3.6不同量的乙醇对解吸效果的影响由图3.6可知，不同用量的乙醇对D101型大孔树脂解吸效果的影响不同，乙醇用量为30～40mL范围内解吸率较大。本实验称取树脂的质量为1.0g，加入70%的乙醇40mL，解吸效果达到最大。故确定洗脱液量为30～40mL为最适宜的解吸液量范围。3.2.6洗脱液pH对解吸效果的影响表3.7乙醇pH对解吸效果的影响乙醇pH吸光度A解吸液黄酮浓度（mg/mL）解吸率（%）20.06550.047472.6830.05150.036353.3340.04550.031538.6350.03100.030638.58图3.7pH对解吸效果的影响由图2.7可以看出，乙醇对吸附饱和的树脂的解吸率随着pH的增加在逐渐降低，pH在2～3时解吸率较大。本实验称取树脂的质量为1.0g，调节乙醇溶液的pH为2时，解吸效果达到最大。故确定洗脱液的pH为2～3为最适宜的解吸液量范围。3.2.7洗脱液浓度对解吸效果的影响表3.8乙醇浓度对解吸效果的影响乙醇体积分数（%）吸光度A解吸液黄酮浓度（mg/mL）60%0.07400.054270%0.08500.063280%0.09100.064595%0.10200.071图3.8乙醇浓度对解吸效果的影响从图3.8可以看出，解吸液黄酮浓度与乙醇的浓度成正比。当洗脱剂的体积分数达到95%时，乙醇从吸附饱和的D101树脂解吸出的黄酮浓度较大，为0.071mg/mL，但乙醇浓度越高，越容易挥发，考虑到生产过程中要满足经济、安全、节约等因素，确定选用70%、80%的乙醇作为洗脱剂。但从图可知，70%、80%的解吸效果接近，考虑到乙醇的利用率，本实验选取70%的乙醇作为洗脱剂。3.3D101型大孔树脂对黄酮物质的动态吸附、解吸分析3.3.1上样液量对吸附效果的影响表3.9上样液量对吸附效果的影响体积（mL）吸光度A吸附液黄酮浓度（mg/mL）吸附率（%）100.10850.0816 58.89200.15240.116541.30300.17560.13532.01400.23000.178310.22500.2320.18049.42600.2350.18148.21700.2320.18049.42图3.9上样液量对吸附效果的影响由图3.9可知，D101型大孔树脂对黄酮类化合物的吸附率与样品溶液的用量在一定范围内成正比。样品溶液中黄酮浓度逐渐增大，当上样液量体积约40mL时，样品溶液中黄酮浓度几乎不在变化，即40mL的上样液量为最佳，这与单因素实验结果一致，故样品溶液最适宜的用量为40mL。3.3.2上样液流速对吸附效果的影响表3.10上样液流速对吸附效果的影响流速（mL/min）吸光度A吸附液黄酮浓度（mg/mL）吸附率（%）10.1720.132133.4520.1830.140929.0530.1860.144927.0440.1880.143327.84图3.10上样液流速对吸附效果的影响由图3.10可得，D101型大孔树脂的解析率与洗脱液流速成反比，流速越大D101型大孔树脂的吸附效果越差。由图可以看出，当流速为1mL/min时，D101型大孔树脂的吸附率最大，流速增大，吸附率下降。流速较大时吸附不够完全，故吸附率较低，流速较小时，更有利于树脂的吸附。因此，选取1～2mL/min为最适宜的上样液流速。3.3.3洗脱流速对解吸效果的影响表3.11洗脱流速对解吸效果的影响流速（mL/min）吸光度A解吸液黄酮浓度（mg/mL）解吸率（%）10.0830.061350.8920.0790.058140.5530.0700.051040.2340.0630.045437.69图3.11洗脱流速对解吸效果的影响由图3.11可得，D101型大孔树脂的解吸率与洗脱液流速成反比。流速越大，D101型大孔树脂的解吸效果越差。由图可以看出，当流速为1mL/min时，D101型大孔树脂的解吸率最大，流速增大，解吸率下降。当流速大于2mL/min时，D101型大孔树脂的解析率几乎不再变化。由此得出，洗脱液流速为1mL/min时，D101型大孔树脂的解吸效果最好，所以可确定最适宜的洗脱流速范围为1mL/min～2mL/min。3.4正交实验3.4.1正交吸附实验表3.12L4（23）正交吸附实验表所在列123因素流速（mL/min）pH上样液量（mL）吸附率（%）实验1133037.66实验2144038.06实验3234024.64实验4243015.22均值137.86031.15026.440均值219.93026.64031.350极差17.9304.5104.910由图3.12可知，根据表的极差数据分析可得，17.930>4.910>4.510，所以影响D101型大孔树脂吸附香椿叶中黄酮类化合物的因素排列顺序为：流速>上样液量>pH，即流速对吸附效果的影响最为显著，其次是上样液体积，pH的影响相对较弱。从均值的数值可以看出，流速为1mL/min比流速为2mL/min的均值大，即流速为1mL/min比流速为2mL/min的吸附效果好，这与单因素实验一致。故较小的流速有利于大孔树脂吸附，所以在适宜的范围内，可以通过适当减小流速，来提高树脂的吸附率。同时由表内数据可以得出：pH为4的吸附效果比pH为3的吸附效果要好；上样液量40mL比30mL的吸附效果好，且与单因素所得实验结果一致。故D101型大孔树脂吸附香椿叶中黄酮类化合物的最佳吸附条件为：流速为1mL/min，上样液量为40mL，pH为4。3.4.2正交解吸实验表3.13L4（23）正交解吸表所在列123因素流速（mL/min）pH浓度（%）解吸率（%）实验1129552.87实验2137044.95实验3227027.79实验4239525.81均值148.91040.33039.340均值226.80035.38036.370极差22.1104.9502.970由表3.13可知，根据表的极差数据分析可得，22.110>4.950>2.970，所以影响D101型大孔树脂吸附香椿叶中黄酮类化合物的因素排列顺序为：流速>pH>浓度,即流速对吸附效果的影响最为显著，浓度的影响相对较弱。从均值的数值可以看出，流速为1mL/min比流速为2mL/min的均值大，即流速为1mL/min比流速为2mL/min的解吸效果好，这与单因素实验一致。同时由表内数据可以得出：洗脱液浓度为95%的解吸效果比洗脱液浓度为70%的解吸效果要好，且所得结果与单因素