基因工程的基本操作程序课件-002

基因工程的基本操作程序公开课2、能否用SARS病毒作为基因载体？3、作为载体，若没有切割位点将怎样？4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？双链DNA不能目的基因不能插入载体上应有标记基因可能造成基因丢失分子搬运工——载体四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因人胰岛素基因目的基因插入点目的基因DNA连接酶目的基因插入点目的基因人胰岛素基因目的基因含有四环素的完全培养基含有氨苄青霉素的完全培养基死亡死亡存活存活死亡存活1.2基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定大肠杆菌的受体细胞含有目的基因(2)检测目的基因是否转录出了mRNA在生物____复制___________的核酸合成技术。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交带，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。3、将目的基因导入受体细胞基因翻译产物蛋白质等特性鉴定（个体生物学水平）目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程2、基因表达载体的构建2、利用PCR技术扩增（序列已知）如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？基因表达载体的构建过程基因的转录产物mRNARNA－DNA杂合双链①概念：PCR全称为_______________，是一项将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。4、目的基因的检测与鉴定短时间内大量扩增目的基因含有氨苄青霉素的完全培养基目的基因是否插入转基因生物的染色体1、从基因文库中获取（序列未知）2、利用PCR技术扩增（序列已知）基因文库基因组文库部分基因文库－－如：cDNA文库聚合酶链式反应一、目的基因的获取3、人工合成(基因比较小，序列已知)反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA（化学合成）依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA

基因翻译产物蛋白质等特性从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。

②原理：__________多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制一段已知目的基因的核苷酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测人工合成法（基因较小，核苷酸序列已知）mRNARNA－DNA杂合双链单链DNA双链DNA逆转录酶DNA聚合酶反转录法化学合成法二、基因表达载体的构建（核心）

1.目的A.使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代B.同时使目的基因能表达和发挥作用2.基因表达载体的组成：a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA3.基因表达载体的构建过程（1）用_________切割质粒，使其出现切口露出____________。（2）用___________切割目的基因，使其产生_________________。（3）将目的基因插入质粒的______处，加入___________，形成了一个重组DNA分子限制酶黏性末端同种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同三、将目的基因导入受体细胞

------转化目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程稳定表达受体细胞方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:a.能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力b.Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上Ti质粒目的基因构建表达载体转入农杆菌整合植物细胞染色体DNA表达新性状外源基因导入植物细胞（2）基因枪法特点：成本高适用于单子叶植物2、能否用SARS病毒作为基因载体？根据已知的氨基酸序列合成DNA（化学合成）方法——抗原-抗体杂交①概念：PCR全称为_______________，是一项基因表达载体的构建过程含有氨苄青霉素的完全培养基抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等使目的基因在受体细胞中稳定存在大肠杆菌的受体细胞含有目的基因2、利用PCR技术扩增（序列已知）如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？含有四环素的完全培养基含有氨苄青霉素的完全培养基如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。将Bt毒蛋白注射小鼠体内部分基因文库－－如：cDNA文库(2)检测目的基因是否转录出了mRNA鉴定（个体生物学水平）目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程大肠杆菌的受体细胞含有目的基因（3）花粉通道法我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞（1）方法：Ca2+处理法（增加细胞膜通透性）（2）微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少（3）过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA四、目的基因的检测与鉴定检测（分子水平）:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:个体生物学水平鉴定（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因A方法:DNA分子杂交B过程:1.检测

基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交带，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。

(2)检测目的基因是否转录出了mRNA①方法:分子杂交法②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。方法——抗原-抗体杂交含有氨苄青霉素的完全培养基a、变性（90℃-95℃）：双链DNA在受热下，_____断裂，形成________（3）将目的基因插入质粒的______处，加入___________，形成了一个重组DNA分子从基因文库中获取目的基因（3）将目的基因插入质粒的______处，加入___________，形成了一个重组DNA分子如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等b、复性（55℃-65℃）：温度降低，引物与单链DNA结合，形成局部________。在生物____复制___________的核酸合成技术。（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质将目的基因导入微生物细胞基因工程的基本操作程序公开课同时使目的基因能表达和发挥作用（2）微生物作受体细胞原因：含有四环素的完全培养基4、目的基因的检测与鉴定2、能否用SARS病毒作为基因载体？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法:抗原-抗体杂交提取方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质

出现杂交带脱分化组织培养2.鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等目的基因的表达和检测抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等抗原－抗体杂交法DNA-RNA分子杂交法DNA分子杂交法受体是否具有转基因特征个体水平目的基因是否翻译目的基因是否转录目的基因是否插入转基因生物的染色体分子水平方法检测对象非编码区非编码区编码区外显子内含子终止子基因的结构启动子原核真核原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码基因翻译产物蛋白质等特性从基因文库中获取目的基因抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等化学合成法、反转录法(2)检测目的基因是否转录出了mRNA含有氨苄青霉素的完全培养基2、利用PCR技术扩增（序列已知）Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上含有氨苄青霉素的完全培养基DNA-RNA分子杂交法（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？2、利用PCR技术扩增（序列已知）同时使目的基因能表达和发挥作用大肠杆菌不含抗四环素基因大肠杆菌不含抗四环素基因DNA-RNA分子杂交法含有四环素的完全培养基②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。三、将目的基因导入受体细胞

------转化编码区非编码区非编码区mRNA前体mRNA单链DNAcDNA转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码系列。即不含非编码区和内含子模板DNAPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶基因组DNA文库与cDNA文库的比较PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束③过程：a、变性（90℃-95℃）：双链DNA在受热下，_____断裂，形成________b、复性（55℃-65℃）：温度降低，引物与单链DNA结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链④方式：以_____方式扩增，即____⑤条件：前提条件:________________⑥结果：指数2n短时间内大量扩增目的基因已知基因的核苷酸序列根据已知的氨基酸序列合成DNA（化学合成）将目的基因导入微生物细胞方法——抗原-抗体杂交大肠杆菌不含抗四环素基因含有四环素的完全培养基如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少方法——抗原-抗体杂交短时间内大量扩增目的基因大肠杆菌的受体细胞含有目的基因c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。在生物____复制___________的核酸合成技术。三、将目的基因导入受体细胞

------转化即不含非编码区和内含子④方式：以_____方式扩增，即____依据：目的基因的有关信息。短时间内大量扩增目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。①概念：PCR全称为_______________，是一项原核细胞与真核细胞的基因结构比较DNA复制PCR技术场所解旋方式酶PCR技术扩增与DNA复制的比较高温解旋酶体外复制主要在细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶（3）人工合成法：

在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成化学合成法、反转录法蛋白质mRNADNA推测推测DNADNA合成仪合成根据已知的氨基酸序列合成DNA法：生物某个发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组DNA与载体连接cDNA文库反转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存②cDNA文库的构建-----逆转录法：

目的基因所在片段运载体PStⅠDNA连接酶重组DNA运载体自连目的基因自连CTTAAGCTTAAGCTTAACTTAAGGPStⅠ运载体的特点3：

有标记基因

导入接种培养接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完全培养基大肠杆菌不含抗四环素基因证明：不存活含有四环素的完全培养基证明：大肠杆菌含抗四环素基因证明：

大肠杆菌的受体细胞含有目的基因

四环素抗性基因

四环素抗性基因完全培养基存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？导入接种培养接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完全培养基大肠杆菌不含抗四环素基因证明：不存活含有四环素的完全培养基证明：大肠杆菌含抗四环素基因证明：

大肠杆菌的受体细胞含有目的基因

四环素抗性基因

四环素抗性基因完全培养基存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？基因文库

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。（便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因。）某种生物的