第二节分子生物学技术

第二节分子生物学技术第1页，课件共23页，创作于2023年2月一、分子生物学进展1.————的建立，奠定了现代分子生物学的基础，给整个生物科学乃至整个人类社会带来了一场革命。2.“基因克隆”一经提出，世界各国的生物科学家便立刻意识到————和基因克隆的重大作用和深远意义。3.目前我国基因工程已投入生产的有————。4.在动物基因工程方面，我国已成功培育出————等多种转基因动物，在动物乳汁中得以表达的物质有————。第2页，课件共23页，创作于2023年2月二、PCR技术（聚合酶链式反应）聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)原理：利用碱基互补配对的原则，人为的将适量的DNA复制过程中所需要的组分组合在一起，经过多次变性、退火、延伸的循环，从而使目的基因在体外得到扩增，最终得到大量的目的基因。

第3页，课件共23页，创作于2023年2月PCR反应中的主要成份

1.引物（两种寡核甘酸）

2.反应物（4种脱氧核苷酸）

3.DNA聚合酶（常用Taq聚合酶）

4.模板DNA5.Mg2+

（提供反应的离子条件）

6.反应缓冲液（提供反应的溶液体系）第4页，课件共23页，创作于2023年2月PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法。包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(40℃~60℃)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下(72℃左右)，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经30轮循环就可使DNA扩增出230

个拷贝。第5页，课件共23页，创作于2023年2月PCR循环–

第一步–变性(94℃)靶序列靶序列第6页，课件共23页，创作于2023年2月PCR循环-第二步–退火(40℃-60℃)靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’第7页，课件共23页，创作于2023年2月PCR循环-第三步–

链延伸(72℃左右)靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase第8页，课件共23页，创作于2023年2月第1个PCR循环完成后–

得到两个拷贝的靶序列靶序列

靶序列BiotinBiotin第9页，课件共23页，创作于2023年2月30次循环后靶序列扩增的数量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon第10页，课件共23页，创作于2023年2月

1stcycle2ndcycle3rdcycle过程变性退火

链延伸第11页，课件共23页，创作于2023年2月PCR三步曲

预变性保温变性94℃延伸72℃退火40~60℃观看Flash第12页，课件共23页，创作于2023年2月PCR反应的特点特异性强灵敏度高完全自动化标本纯度要求低第13页，课件共23页，创作于2023年2月

PCR仪的介绍中学专用PCR仪科研用PCR仪第14页，课件共23页，创作于2023年2月

中学专用PCR仪与科研用仪器相比具有许多优点：

1.操作简便，实验直观

2.PCR原理完整展现

3.彩色大屏幕，中文菜单，便于学习加深理解第15页，课件共23页，创作于2023年2月

琼脂糖凝胶电泳一、基本概念

以琼脂糖凝胶作为介质,DNA在外加电场的作用下泳动的技术.二、实验原理

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA通常是带负电荷的，所以在外加电场作用下会向正极泳动。泳动的速度与DNA片断的长度成负相关，利用这一性质可以分离不同长度的DNA，从而可以检测PCR产物。琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围

第16页，课件共23页，创作于2023年2月三、琼脂糖凝胶电泳中缓冲液的含义及作用电泳缓冲液：载样缓冲液的作用：

增加样品密度，保证DNA均匀沉入加样孔内使样品呈色，便于上样

在电泳中形成可见指示带，预测电泳进程维持电泳过程中的合适的pH第17页，课件共23页，创作于2023年2月

电泳仪和电泳槽电泳仪：提供电泳所需要的恒定的电压或电流。水平电泳槽：进行电泳的场所。第18页，课件共23页，创作于2023年2月

DNA染色DNA染料可嵌合入DNA分子，并与DNA样品一起电泳，在特定激发光源的激发下可发出荧光。荧光强度与DNA含量成正比。

1、溴化乙锭（EB）与DNA嵌合后，在紫外光照射下发射红橙色荧光。EB有致癌性，紫外线可诱发皮肤癌，需专门仪器。

2、核酸荧光染料与DNA嵌合后，只需可见光激发即发射黄绿色荧光。无毒害，仪器简单。第19页，课件共23页，创作于2023年2月

DNA图谱观察仪DNA图谱观察仪是用于DNA琼脂糖凝胶电泳结果图谱观察的仪器。DNA电泳图谱观察仪具有安全、环保、灵敏、方便等特点。第20页，课件共23页，创作于2023年2月PCR、电泳及观察仪器与材料

材料PCR试剂盒琼脂糖凝胶电泳试剂盒其他PCR仪电泳仪电泳槽DNA图谱观察仪移液器0.5mL离心管液体石蜡仪器第21页，课件共23页，创作于2023年2月电泳观察PCR反应

实验步骤第22页，课件共23页，创作于2023年2月PCR体系：

PCR混合液