第三章蛋白质化学

第三章蛋白质化学第1页，课件共146页，创作于2023年2月第一节蛋白质分子的组成成分第四节肽第二节氨基酸的性质第三节氨基酸的分离与鉴定第五节蛋白质的分类第2页，课件共146页，创作于2023年2月第六节蛋白质的一级结构第七节蛋白质的高级结构第八节几种蛋白质的结构与功能第九节蛋白质的结构与功能的关系第十节蛋白质的性质第十一节蛋白质的分离、纯化与鉴定第3页，课件共146页，创作于2023年2月第一节蛋白质分子的组成成分一.蛋白质的元素组成三.蛋白质的基本单位——氨基酸二.蛋白质的水解第4页，课件共146页，创作于2023年2月每克样品中的含氮量×6.25×100＝蛋白质含量（%）蛋白质与糖、脂肪不同，除碳、氢、氧外，还含有氮元素。生物体内的氮量可当作全部为蛋白质所有，体内大多数蛋白质的含氮量接近于16%，故可以通过测定生物样品中的含氮量算出蛋白质含量16%1

式中6.25=公式为：一.蛋白质的元素组成第5页，课件共146页，创作于2023年2月三.蛋白质的基本单位——氨基酸蛋白质是分子质量很大的一类高分子化合物，蛋白质与糖、脂肪不同之处在于蛋白质由一种基本单位组成。组成蛋白质的基本单位是氨基酸(aminoacid简写为AA),结构如下H2第6页，课件共146页，创作于2023年2月

因此氨基酸的结构通式为：天然氨基酸都是α-氨基酸，式中R表示不同的化学基团，R基不同则形成不同的氨基酸αR－CH－COOHNH2三.蛋白质的基本单位——氨基酸(一)构成蛋白质的氨基酸(二)非蛋白氨基酸氨基酸是具有氨基的羧酸,其中氨基是连在与羧基相邻的碳原子上。第7页，课件共146页，创作于2023年2月用希腊字母表示与羧基相邻的碳原子εαδγβ第8页，课件共146页，创作于2023年2月组成蛋白质的氨基酸有20种，名称和符号如下:氨基酸中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸(一)构成蛋白质的氨基酸20种氨基酸按酸碱性质分为三类:第9页，课件共146页，创作于2023年2月第10页，课件共146页，创作于2023年2月第11页，课件共146页，创作于2023年2月中性氨基酸是指含一氨基和一羧基的氨基酸按侧链基团的不同，分为五类：中性氨基酸脂肪族氨基酸芳香族氨基酸含羟基氨基酸含硫氨基酸亚氨基酸甘、丙、缬、亮、异亮苯丙、酪、色丝、苏半胱、甲硫（蛋）脯1.中性氨基酸非极性氨基酸极性氨基酸酰胺类氨基酸天胺、谷胺第12页，课件共146页，创作于2023年2月谷酰胺＜天冬酰胺＜苏氨酸＜丝氨酸＜脯氨酸＜半胱氨酸甘氨酸＜丙氨酸＜缬氨酸＜亮氨酸＜异亮氨酸＜酪氨酸＜甲硫氨酸＜苯丙氨酸＜色氨酸上述五类氨基酸可按极性强弱排序：要点1.非极性氨基酸2.极性氨基酸主要为脂肪族和芳香族氨基酸主要为含羟基和含硫氨基酸1.中性氨基酸第13页，课件共146页，创作于2023年2月谷氨酸＜天冬氨酸酸性强弱为：2.酸性氨基酸含一氨基和两羧基的氨基酸称为酸性氨基酸，有谷氨酸和天冬氨酸两种上述两种酸性氨基酸的羧基化后产生两种中性酰胺：天冬酰胺和谷氨酰胺第14页，课件共146页，创作于2023年2月赖氨酸＜组氨酸＜精氨酸碱性强弱为：3.碱性氨基酸含两氨基和一羧基的氨基酸称为碱性氨基酸，有精氨酸，赖氨酸，组氨酸三种第15页，课件共146页，创作于2023年2月问题120种氨基酸中有多少种极性氨基酸？1.R-基不带电荷的AA（中性AA）：Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Pro3.R-基带负电荷的AA（酸性AA）：Glu,Asp2.R-基带正电荷的AA（碱性AA）：Lys、Arg、His极性AA共有11种：由于酸碱性氨基酸属于最强极性第16页，课件共146页，创作于2023年2月问题220种氨基酸在水中的溶解性程度如何？极性与溶解性关系为：相似相溶即极性物质溶于极性溶剂中，非极性物质溶于非极性溶剂因此20种氨基酸在水中的溶解性为酸碱性氨基酸极性氨基酸非极性氨基酸＞＞酸碱性氨基酸为最强极性，其次为极性氨基酸和非极性氨基酸第17页，课件共146页，创作于2023年2月第二节氨基酸的性质一.氨基酸的光学活性和光吸收性质二.氨基酸的解离和两性性质三.氨基酸的化学反应第18页，课件共146页，创作于2023年2月规定：α-氨基排布在不对称碳原子左边的为L－型，在右边的为D－型.H－C－NH2RCOOHNH2－C﹡－HRCOOHL－氨基酸D－氨基酸由结构可知，氨基酸的α－碳原子为不对称碳原子，故氨基酸有立体构型和旋光异构体.如图：1.光学活性要点﹡第19页，课件共146页，创作于2023年2月从天然蛋白质分离得到的氨基酸都是L－氨基酸NH2－C－HHCOOH甘氨酸20种氨基酸中只有甘氨酸的R基为氢原子。因此甘氨酸的α－碳原子不是不对称碳原子，甘氨酸没有DL构型故组成蛋白质的氨基酸在结构上都为L－α-氨基酸要点1.光学活性第20页，课件共146页，创作于2023年2月共轭双键：指单双键交替的结构例2.光吸收性质CH3－CH＝CH－CH＝CH21，3-二戊烯苯氨基酸在可见光区都没有光吸收，在紫外区只有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸具有光吸收能力.因为这三种氨基酸有苯环（共轭双键）结构.此性质可用于鉴定此三种氨基酸第21页，课件共146页，创作于2023年2月苯丙酪色第22页，课件共146页，创作于2023年2月按酸碱的定义，由于氨基酸具有酸性的羧基和碱性的氨基，因此具有酸碱两性。二.氨基酸的解离和两性性质1.氨基酸的解离2.氨基酸的等电点第23页，课件共146页，创作于2023年2月R－CHNH2COOHR－CHNH2COO-R－CHNH3+COOH氨基酸在水溶液中既可以作为酸释放质子，带负电荷H++也可以作为碱接受质子，带正电荷：R－CHNH2COOH+H+1.氨基酸的解离第24页，课件共146页，创作于2023年2月故氨基酸具有两性，在水溶液中以兼性离子形式存在:此时氨基酸净电荷为零要点1.氨基酸的解离非电离式兼性离子第25页，课件共146页，创作于2023年2月当氨基酸兼性离子处于酸性环境中时，氨基酸可作为碱接受质子，从而带正电荷R－CHNH3+COO-R－CHNH3+COO-R－CHNH2COO-R－CHNH3+COOH反之，当氨基酸处于碱性环境时，可作为酸释放质子，从而带负电荷H++H++2.氨基酸的等电点氨基酸兼性离子同氨基酸一样也具有两性第26页，课件共146页，创作于2023年2月故肯定存在某一pH值，此时氨基酸的净电荷为零，正负电荷相等，氨基酸以兼性离子形式存在.此时的pH值称为等电点，用pI表示

定义：使氨基酸所带正电荷和负电荷相等，即净电荷为零时的pH值称为等电点即氨基酸在酸性环境中带正电，在碱性环境中带负电即随着pH值升高，氨基酸由带正电逐渐变为带负电2.氨基酸的等电点pI=1/2（pK1′+pK2′）要点第27页，课件共146页，创作于2023年2月各种氨基酸的pK1′和pK2′见表3-5，可据此算出各氨基酸的pI值酸性氨基酸天冬氨酸有三个解离基团：对含有三个解离基团的氨基酸，则有三个pK值,此时pI值由兼性离子(A±)两侧的pK值算出NH3+－CHCH2COOHCOOH解离过程为从正离子开始，pK值小的基团先解离，pK值大的基团后解离例要点①等电点的推导和计算第28页，课件共146页，创作于2023年2月NH3+－CHCH2COOHCOOHNH3+－CHCH2COO-COOHNH3+－CHCH2COO-COO-NH2－CHCH2COO-COO-pK1′pK2′pK3′A±A-A+A2-pI=pK1′+pK2′2则解离方程为：=1/2（2.09+3.86）=2.98对pK3′的解离及A2-离子的存在则忽略不计①等电点的推导和计算第29页，课件共146页，创作于2023年2月环境pH＞pI时，氨基酸带负电荷.pH与pI相差越大，带电荷越多环境pH＜pI时，氨基酸带正电荷.pH与pI相差越大，带电荷越多引入等电点后，环境pH与氨基酸的带电关系可重新描述为：要点①等电点的推导和计算第30页，课件共146页，创作于2023年2月问题写出碱性氨基酸赖氨酸的解离方程，以及pI的计算公式？则碱性氨基酸为pI=pK2′+pK3′2NH3+－CH

（CH2）4COOHNH3+NH3+－CH

（CH2）4COO-NH3+NH2－CH

（CH2）4COO-NH3+NH2－CH

（CH2）4COO-NH2pK1′pK2′pK3′A±A-A+A2+第31页，课件共146页，创作于2023年2月故二式可合并为：在（4）式中，分母的A±释放质子，分子的A-接受质子在（3）式中，分母的A+释放质子，分子的A±接受质子A+H++A±K1′〔A±〕㏒pK1′+pH=〔A+〕比较两式〔A±〕〔A-〕㏒pK2′+pH=A±A-+H+K2′（3）式（4）式②氨基酸pH的计算第32页，课件共146页，创作于2023年2月因此已知了解离基团，质子供体和受体的浓度，就可算出此时氨基酸溶液的pH值式中pK′的选择取决于氨基酸由－COOH还是NH3+－解离是－COOH解离则选择pK1′，是NH3+－解离则选择pK2′②氨基酸pH的计算〔质子供体〕〔质子受体〕pK′+㏒pH=第33页，课件共146页，创作于2023年2月可知由COO-接受质子，解离常数应选择pK1′，查表pK1′=2.34R－CHNH3+COO-R－CHNH3+COOH+H+解：处于等电点时丙氨酸为兼性离子A±,故由A±来接受质子方程为问题向1L浓度为1mol/L处于等电点的丙氨酸溶液中加入0.4mol的HCl（体积忽略），问溶液pH为多少?第34页，课件共146页，创作于2023年2月=2.52=2.34+0.40.6㏒=pK1′+〔A+〕〔A±〕㏒A±+H+A+

反应前10.40反应平衡时1-0.400.4故pH=pK1′+〔质子供体〕〔质子受体〕㏒第35页，课件共146页，创作于2023年2月脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应不释放NH3直接生成黄色化合物此反应是氨基酸的特异反应，可用于定性定量测定茚三酮在微酸性溶液中与氨基酸加热，发生氧化脱羧、脱氨作用生成蓝紫色化合物

茚三酮反应（三）由氨基和羧基同时参与的反应第36页，课件共146页，创作于2023年2月氨基酸的侧链基团具有一些特殊性质与反应，尤其是个具特殊的颜色反应，这些反应常用作各种氨基酸的测定一些侧链基团的反应和用途见下表（四）由R基参与的反应第37页，课件共146页，创作于2023年2月表3-2氨基酸侧链基团的部分反应R基名称化学反应

用途

苯环（苯丙氨酸）黄色反应：与HNO3作用产生黄色物质鉴定苯丙氨酸酪氨酸

酚基（酪氨酸）Millon反应：与HNO3HgNO3反应呈红色鉴定酪氨酸吲哚基（色氨酸）乙醛酸反应：紫红色鉴定色氨酸胍基（精氨酸）坂口反应：产生红色作精氨酸的测定咪唑基（组氨酸）Pauly反应：与重氮盐生成棕红色组氨酸的测定巯基（半胱氨酸）亚硝基亚铁氰酸钠反应：生成红色作半胱氨酸和胱氨酸测定第38页，课件共146页，创作于2023年2月第三节氨基酸的分离与测定一.层析法三.氨基酸的显色反应二.电泳法第39页，课件共146页，创作于2023年2月此方法以滤纸为支持物，以滤纸纤维所吸附的水为固定相，以水饱和的有机溶剂为移动相.将氨基酸的混合样品点于滤纸上①滤纸层析当有机溶剂经过样品时，各组分氨基酸就在水和有机相中分配.由于水被固定而有机相不断前进，不同氨基酸在水和有机相中的分配情况（即溶解度）不同，则各氨基酸随有机相前进的速度就不一样，经一定时间后，即可分离.第40页，课件共146页，创作于2023年2月分配系数=溶质在水中的溶解度溶质在有机溶剂中的溶解度分配情况用分配系数表示：由于混合物中各组分的分配系数不同，经过一定时间的多次分配后，各组分即可完全分开①滤纸层析第41页，课件共146页，创作于2023年2月各种物质在层析中前进的速率可用Rf（比移值）来表示原点到溶剂前沿的距离原点到层析点中心的距离Rf=样品混合液（原点）溶剂前沿层析点中心原点到层析点中心的距离原点到溶剂前沿的距离①滤纸层析第42页，课件共146页，创作于2023年2月则氨基酸的分离即取决于氨基酸的在有机相和水相中的溶解度.②非极性氨基酸易溶于有机溶剂，前进速度快，Rf

值大.故非极性越强，移动距离越远，Rf值越大①极性氨基酸易溶于水，前进速度慢，Rf值小.故极性越强，移动距离越短，Rf值越小要点因此Rf值的不同导致氨基酸的分离，Rf值越大，说明该物质前进速度越快，即在有机相中溶解度越大①滤纸层析第43页，课件共146页，创作于2023年2月故滤纸层析的分离规律如下：滤纸从下至上非极性氨基酸极性氨基酸酸碱性氨基酸混合氨基酸样品①滤纸层析第44页，课件共146页，创作于2023年2月问题纸层析分离丙、精、亮、丝、苏氨酸时，各氨基酸分离结果如何？(滤纸从上到下)由前述氨基酸分类精氨酸为碱性氨基酸则Rf值大小次序为亮氨酸精氨酸＞丝氨酸＞丙氨酸＞苏氨酸＞丝、苏氨酸为极性氨基酸丙、亮氨酸为非极性氨基酸则分离结果按滤纸从上到下依次为:亮氨酸,丙氨酸,苏氨酸,丝氨酸,精氨酸第45页，课件共146页，创作于2023年2月离子交换层析是用一种离子交换树脂填装于柱内进行层析的方法.有阳离子树脂和阴离子树脂两种。阳离子树脂含有酸性基COOH或SO3H

，可释放H+，H+可和溶液中其他阳离子发生交换，使阳离子结合到树脂上去。2.离子交换层析由于各种氨基酸PI值和大小不同，故在同一pH下所带电荷不同，与树脂的亲和能力也不同，当pH改变时，则各种氨基酸因洗脱顺序不同而分离阳离子树脂层析分为上样、交换、洗脱三个步骤第46页，课件共146页，创作于2023年2月③极性相同时，分子量小的先洗下②对中性氨基酸，非极性氨基酸与树脂的亲和力大，则后被洗下；极性氨基酸与树脂的亲和力小，则先被洗下①在酸性环境下，碱性氨基酸PI最大，带电最多，与酸根结合力最强，故最后被洗下。酸性氨基酸pI最小，所带电荷最少，所以最先被洗下；对阳离子交换层析具有如下规律2.离子交换层析第47页，课件共146页，创作于2023年2月则阳离子交换层析的洗脱顺序先后如下：要点酸性氨基酸→极性氨基酸→非极性氨基酸→碱性氨基酸2.离子交换层析第48页，课件共146页，创作于2023年2月问题以阳离子树脂分离天冬、丙、精、亮、丝氨酸，则洗脱顺序如何？五种氨基酸中天冬氨酸为酸性氨基酸精氨酸为碱性氨基酸丝氨酸为极性氨基酸丙、亮为非极性氨基酸，亮氨酸＞丙氨酸故洗脱顺序为：天冬氨酸丝氨酸丙氨酸亮氨酸精氨酸由前述氨基酸分类第49页，课件共146页，创作于2023年2月电泳法是利用带电质点在电场中移动的方向和速度的不同而进行分离的方法二.电泳法

定义：电泳是指带电质点在电场中向电荷相反方向移动的现象第50页，课件共146页，创作于2023年2月带电质点在电场中受静电引力向电荷相反方向移动，引力与质点所带电荷成正比同时质点受介质阻力，阻力与质点大小成反比由于混和样品中各组分的大小和所带电荷不同，因此利用移动速度和方向的不同可以将各组分分开﹣﹣++++－电场二.电泳法电泳时采用纤维薄膜或凝胶作为介质,可垂直或水平电泳第51页，课件共146页，创作于2023年2月③当两种氨基酸的pI值相差很小（0.01）时，移动速度取决于分子量，分子量越小，移动越快②环境pH﹤pI时，氨基酸带正电荷，向电场负极移动，pH和pI相差越大，带电越多，移动越快①环境pH﹥pI时，氨基酸带负电荷，向电场正极移动，pH和pI相差越大，带电越多，移动越快氨基酸的电泳速度取决于带电多少和分子量大小，具有如下规律：要点二.电泳法第52页，课件共146页，创作于2023年2月问题以下氨基酸在pH=4条件下电泳时，电泳行为和次序如何？缬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，亮氨酸，丝氨酸pI值分别为5.973.229.745.985.68谷氨酸pI﹤pH，带负电荷，向电场正极移动缬、赖、亮、丝pI﹥Ph，带正电荷，向负极移动到达电场负极的次序为：赖氨酸缬氨酸亮氨酸丝氨酸而缬氨酸和亮氨酸pI值相差不大,分子量亮氨酸大于缬氨酸第53页，课件共146页，创作于2023年2月第四节肽一.肽的结构二.天然活性肽第54页，课件共146页，创作于2023年2月

定义：由两个以上的氨基酸通过肽键连接起来的化合物，称为肽肽是由氨基酸通过固定方式连接而成的化合物，可由蛋白质水解产生，也有天然存在的肽一.肽的结构

两个以上氨基酸形成肽时，是由一个氨基酸的α-氨基和另一个氨基酸的α-羧基缩合失去一分子水而形成的，所生成的化学键叫肽键肽键的结构式应包括形成肽键的四个原子，且H和O呈反式排列C－NHO即第55页，课件共146页，创作于2023年2月肽键第56页，课件共146页，创作于2023年2月书写时通常将N末端写在左，C末端写在右H2N－CH－CO－NH－CH－CO－NH－CH－COOHR1

R3R2丝甘苏每一个肽的一端都有一个游离的α-氨基，称为氨基末端（N末端），另一端有一个游离的α-羧基，称为羧基末端（C末端）

肽键要点N末端C末端一.肽的结构第57页，课件共146页，创作于2023年2月（一）谷胱甘肽谷胱甘肽是一种三肽，广泛存在于动植物和微生物细胞内，在体内的氧化还原反应中起重要作用谷胱甘肽由L﹣谷氨酸、L﹣半胱氨酸和甘氨酸组成，因含有巯基－SH，常简写为GSH，可参与氧化还原反应2GSHG－S－S－G-2H+2H二.天然活性肽因此GSH的巯基可作为体内的还原剂保护某些蛋白质和酶的巯基免遭一些有机毒物的氧化第58页，课件共146页，创作于2023年2月第六节蛋白质的一级结构第59页，课件共146页，创作于2023年2月三.蛋白质的一级结构的测定测定蛋白质的氨基酸顺序步骤如下：肽链末端分析，确定蛋白质由几条肽链组成测定各个片段的氨基酸的顺序测定肽链的氨基酸组成（如前述）将肽链水解为小片段并分离拆开蛋白质的几条肽链并分离拼凑出整个肽链的顺序第60页，课件共146页，创作于2023年2月（一）肽链末端分析一条肽链只具有一个N－末端和C

－末端，故分析肽链末端氨基酸的数目可确定蛋白质由几条肽链构成）。肽链末端分析包括N－末端分析和C－末端分析第61页，课件共146页，创作于2023年2月FNO2O2N①二硝基氟苯法（DNFB法)（二硝基氟苯）1.N－末端分析所得的DNP－氨基酸为黄色，可用乙醚抽提。然后用纸层析法定性DNFB可与肽链N－末端的自由氨基反应，生成硝基苯衍生物称为DNP－肽链，其中DNFB与氨基的键比肽键稳定，故用酸水解时，肽键全被破坏，生成一个DNP－氨基酸和其余所有氨基酸的混合物第62页，课件共146页，创作于2023年2月②苯异硫睛法(Edman法)所得PTH氨基酸用乙酸乙酯抽提后，可用纸层析鉴定优点：用PITC法得到的剩余肽链，还可重复应用此法，测定递减一位的氨基酸，以至测定整个片段的顺序，这种方法叫Edman法。现已有根据此原理设计的氨基酸顺序自动分析仪1.N－末端分析苯异硫睛（PITC）与肽链N－末端的自由氨基反应，形成苯氨基硫甲酰衍生物，简称PTC－肽链，PTC－肽链在酸性溶液中环化得PTH氨基酸和少一个N－末端氨基酸的肽链第63页，课件共146页，创作于2023年2月①肼解法2.C

－末端分析肼解下来的C

－末端氨基酸借DNFB作用转变为黄色的DNP－氨基酸，然后用乙醚抽提并用层析鉴定多肽与肼在无水条件下加热可断裂所有肽键，除C

－末端氨基酸外，其他氨基酸都变成相应的酰肼衍生物第64页，课件共146页，创作于2023年2月

羧肽酶是一种专门水解肽链C

－末端氨基酸的蛋白水解酶，不同的羧肽酶有不同作用方式。常用羧肽酶有两种羧肽酶B：只水解释放肽链C－末端为Arg(精),Lys(赖)的氨基酸羧肽酶A：除肽链C－末端为Pro(脯),Arg(精),Lys(赖)氨基酸外，能水解释放C－末端其他氨基酸②羧肽酶法要点2.C

－末端分析第65页，课件共146页，创作于2023年2月(二）肽链的拆开和分离由蛋白质N－末端数目可知蛋白质由几条肽链组成，故须把肽链分离,再分别测定每条肽链的顺序肽链间通常由二硫键连接，故须把二硫键打开使肽链分离。二硫键是一种共价键，常用方法为氧化还原法非共价键的如氢键、离子键、疏水键、范德华力4种，可用尿素或盐酸胍等有机溶液来拆分。第66页，课件共146页，创作于2023年2月－S－S－－S－S－

C

C

N

N－SH－SH

C

N

C

NHS－HS－+－SCH2COOH－SCH2COOH

C

N

C

NHOOCCH2S－HOOCCH2S－+HOCH2CH2SH（巯基乙醇）ICH2COOH（碘醋酸）氧化还原法：通常用巯基乙醇处理，然后用碘醋酸保护还原生成的半胱氨酸的巯基，防止被重新氧化第67页，课件共146页，创作于2023年2月（三）将肽链水解为小片段并分离2.若肽链含氨基酸很多，则须将肽链分解为几个小片段，测定片段顺序肽链水解的的方法有以下两种：溴化氰裂解和酶解法。多肽经部分水解产生的大小肽段，可应用层析和电泳的方法加以分离提纯1.若肽链较短，则可用前述Edman法直接测序，但Edman法最多能测定几十个（60～70）氨基酸第68页，课件共146页，创作于2023年2月····HN－CH－CO－NH－CH－CO－NH－CH－CO····

R1

R2R3胰蛋白酶：R1=Lys（赖）Arg（精）胃蛋白酶：R1和R2=Phe（苯丙），Leu（亮）,Trp（色），Tyr（酪）弹性蛋白酶:R1=Ala,Val,Leu溴化氰:R1=Met作用点糜蛋白酶:R1=Phe,Trp,Tyr第69页，课件共146页，创作于2023年2月溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸（Met）羧基端的肽键，产物为C－末端都是甲硫氨酸的肽片段（肽链C－末端除外）1.溴化氰裂解作用点····HN－CH－CO－NH－CH－CO－NH－CH－CO····

R1

R2R3R1：甲硫氨酸基团－CH2－CH2－S－CH3第70页，课件共146页，创作于2023年2月

酶解法采用蛋白酶水解，不同的蛋白水解酶作用点不同，产生的片段大小和末端均不一样，更容易用于肽链的分析。常用的蛋白酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶2.酶解法第71页，课件共146页，创作于2023年2月胰蛋白酶：只切断肽链中赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)的羧基端肽键，产生以Lys或Arg为C

－末端的肽片段糜蛋白酶:切断含苯环氨基酸（苯丙Phe,色Trp,酪Tyr）的羧基端肽键，产生以上述氨基酸为为C－末端的肽片段胃蛋白酶：要求被断裂键两侧的残基都是疏水性氨基酸，如苯丙Phe，色Trp,亮Leu弹性蛋白酶:切断小分子疏水性氨基酸（丙Ala,亮Leu,缬Val)的羧基端肽键，产生以上述氨基酸为为C－末端的肽片段第72页，课件共146页，创作于2023年2月可用Edman法测定片段的氨基酸顺序，再推断出整个多肽链的顺序（四）测定每一片段的氨基酸顺序但有时肽链的末端氨基酸与片段切口的氨基酸相同时，则不能一次推断出肽链的顺序。此时需用几种方法来断裂多肽样品，产生几套片段，通过比较片段的切口重叠情况来推断出氨基酸顺序第73页，课件共146页，创作于2023年2月则该多肽的氨基酸顺序为：苏－亮－－谷－精－苯丙－N－丙酪－C赖－某多肽经测定N－末端为丙氨酸，C－末端为酪氨酸，经胰蛋白酶水解产生三个片段，一个含有谷，丙，精氨酸，第二个片段含亮，赖，苏氨酸，此片段与DNFB反应得DNP苏氨酸，第三个片段含有酪，苯丙氨酸。判断此多肽顺序问题第74页，课件共146页，创作于2023年2月则通过片段重叠法推得此多肽顺序为：－亮－某多肽经测定N－末端为丙氨酸，C－末端为酪氨酸，经胰蛋白酶水解为四个片段，顺序分别为：丙酪苏赖，缬苯丙丝精，谷酪，丙亮精。若将此多肽经糜蛋白酶水解，产生四个片段，顺序分别为：丙亮，苏赖缬苯丙，精丙酪，丝精谷酪N－丙酪－C谷－丝－精－缬－苯丙－苏－赖－丙－酪－精－问题第75页，课件共146页，创作于2023年2月第七节蛋白质的高级结构一.蛋白质各级结构的概念二.构型与构象三.蛋白质的二级结构四.超二级结构和结构域五.蛋白质的三级结构六.蛋白质的四级结构七.蛋白质一级结构对高级结构的影响第76页，课件共146页，创作于2023年2月一.蛋白质各级结构的概念蛋白质具有不同的结构层次，分别为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。其中一级结构称为初级结构，二、三、四级结构称为高级结构。各级结构的形状和维持力都不同第77页，课件共146页，创作于2023年2月一级结构定义一级结构指肽链中的氨基酸排列顺序维系此结构的化学键是肽键第78页，课件共146页，创作于2023年2月

二级结构定义多肽链按照一定的方式规则的旋转或折叠，称为蛋白质的二级结构二级结构不涉及侧链R基，维系此结构的化学键是氢键第79页，课件共146页，创作于2023年2月三级结构定义螺旋形的肽链非几何的进一步折叠或卷曲构成复杂的空间结构，整个分子成为球状或颗粒状，称为三级结构盐键、疏水作用、范德华力参与三级结构的形成第80页，课件共146页，创作于2023年2月四级结构由两条或两条以上多肽链构成的蛋白质分子，其每条单位肽链叫亚基，亚基与亚基之间的结合方式称为四级结构定义第81页，课件共146页，创作于2023年2月三.蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构只限于主链原子的局部空间排列，不包括与肽链其他区段的关系和侧链R基构象,蛋白质借助氢键盘旋折叠而形成局部空间结构二级结构包括：α-螺旋、β－折叠、β－转角和无规卷曲几种形式第82页，课件共146页，创作于2023年2月α-螺旋结构的理论要点：1.组成肽键的四个原子在同一平面上，称为肽平面，四个原子呈反式排列,肽平面的键长键角一定2.肽平面(peptideplane)是组成多肽链的基本单位。相邻肽平面通过螺旋扭转构成二面角，蛋白质分子为卷曲的右手螺旋结构第83页，课件共146页，创作于2023年2月4.肽链内通过氢键来维持结构，氢键由第一个氨基酸残基酰胺基团的－CO基与其相邻的第四个氨基酸残基酰胺基团的－NH基形成氢键，氢键方向平行于螺旋的轴5.螺旋结构用SN表示.S为螺旋一圈所含的残基数，N为从形成氢键的氧到氢原子之间所包含的主链的原子数目。典型的α－螺旋结构可用表示3.6133.肽链螺旋的螺距一定，为0.54nm，螺旋一圈含3.6个氨基酸残基，则相邻两个氨基酸的距离为0.15nm第84页，课件共146页，创作于2023年2月第85页，课件共146页，创作于2023年2月第86页，课件共146页，创作于2023年2月第87页，课件共146页，创作于2023年2月0.15nm0.54nm第88页，课件共146页，创作于2023年2月氢键氢键氢键第89页，课件共146页，创作于2023年2月NHCOCR2NHCOCR3NHCOCR4R1NHCOCCRα-螺旋结构如下图：氢键肽平面α碳原子螺旋轴第90页，课件共146页，创作于2023年2月α-螺旋结构第91页，课件共146页，创作于2023年2月（二）β－折叠结构丝蛋白肽链不具备象α-螺旋那样的结构，因此Pauling提出了β－折叠结构以解释丝蛋白的结构。β－折叠结构理论要点如下β－折叠结构主要存在于蜘蛛、蚕的丝蛋白中。第92页，课件共146页，创作于2023年2月1.β－折叠结构的肽链是完全伸展的，成一种折叠的形式2.α－碳原子总在肽平面相互折叠的角上，R基与棱角垂直，两个氨基酸距离为0.35nm3.氢键由肽链与肽链之间或一条肽链的不同区段间形成，所有肽键都参与链间氢键的交联，氢键方向垂直于链的方向4.β－折叠有平行式和反平行式两种类型β－折叠结构理论要点第93页，课件共146页，创作于2023年2月C＝OH－NN－HO＝CC＝OH－NN－HO＝CH－NC＝OH－NC＝OO＝CN－HO＝CN－HH－NC＝OC＝OH－N氢键R基β－折叠结构如下图：α碳原子肽平面第94页，课件共146页，创作于2023年2月平行式β－折叠俯视图侧视图第95页，课件共146页，创作于2023年2月反平行式β－折叠俯视图侧视图第96页，课件共146页，创作于2023年2月（三）β－转角1.在蛋白质分子中,肽链出现的的180°回折结构，称为β－转角2.β－转角通常由四个连续的氨基酸组成，第一个残基的－CO基与第四个残基的－NH基形成氢键HCOCOCHNC－CO－N－CHNCR1R2R3R4氢键第97页，课件共146页，创作于2023年2月（四）无规卷曲此外还有一种无规卷曲结构，指没有规律性的部分肽链构象，包括π－螺旋，Ω环α-螺旋、β－折叠和β－转角是构成蛋白质空间结构的基本形式。第98页，课件共146页，创作于2023年2月在一些球状蛋白分子中，常出现若干相邻的二级结构单元按照一定规律的组合在一起，彼此相互作用，这种结构组合单元称为超二级结构四.超二级结构和结构域常见的超二级结构单元为αα，βαβ，βββ第99页，课件共146页，创作于2023年2月一些相当大的蛋白质分子，需要先分别折叠成几个相对独立的区域，再组装为更高级结构，这种在二级或超二级结构基础上通过多次折叠形成的特定区域称为结构域结构域在空间上形成一些半独立的球状结构，它是三级结构的一部分，结构域之间靠无规卷曲连接。也就是将三级结构拆开后首先看到的结构

四.超二级结构和结构域第100页，课件共146页，创作于2023年2月αβαβααβββ转角第101页，课件共146页，创作于2023年2月ααβαββββ第102页，课件共146页，创作于2023年2月磷酸甘油脱氢酶的两个结构域结合结构域催化结构域第103页，课件共146页，创作于2023年2月4.蛋白质形成三级结构后才有生理活性3.维持三级结构的作用力有氢键、疏水作用、盐键、范德华力，其中最重要的是疏水作用五.蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构是在二级结构基础上进一步形成的，具有以下特点：2.蛋白质分子在三维空间沿多个方向进行卷曲、折叠、盘绕，使整个分子成为紧密的近似球状或颗粒状1.三级结构是由蛋白质二级结构不同区段的R基相互作用形成的空间构象，包括肽链的所有原子，但不包括肽链间的相互关系第104页，课件共146页，创作于2023年2月肌红蛋白三级结构以α螺旋为主脯氨酸血红素第105页，课件共146页，创作于2023年2月3.亚基在蛋白质构象中的空间排布方式及亚基间的相互作用关系，即称为四级结构，维系亚基间的化学键主要是疏水作用1.蛋白质由两条或多条肽链构成，肽链间并无共价键（二硫键）连接，每条肽链都有各自的一二三级结构六.蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构的特点如下：2.这种无共价键连接的肽链单位称为亚基，单独的亚基没有生理活性.亚基构成蛋白质四级结构后才有生理活性第106页，课件共146页，创作于2023年2月血红蛋白单体和四级结构第107页，课件共146页，创作于2023年2月胰岛素由两条肽链组成，则胰岛素具有四级结构吗？问题1胰岛素的两条肽链间是以共价键（二硫键）连接的，因此胰岛素不具有四级结构，胰岛素的两条肽链也不是亚基第108页，课件共146页，创作于2023年2月一个蛋白质多肽链只要具有三级结构就有了生物活性，这种说法正确吗？问题2不一定如果是单肽链蛋白质，则这种说法正确但如果这个多肽链是一个亚基，则需形成四级结构后才有活性第109页，课件共146页，创作于2023年2月牛胰岛素结构牛胰岛素由两条肽链组成，一条含有21个氨基酸残基，称为A链，另一条含有30个氨基酸残基，称为B链.肽链间由由两个二硫键连接，A链内还有一个二硫键。第110页，课件共146页，创作于2023年2月第十节蛋白质的性质一.蛋白质的两性解离与等电点二.蛋白质分子的大小三.蛋白质的胶体性质四.蛋白质的沉淀作用五.蛋白质的变性作用六.蛋白质的颜色反应第111页，课件共146页，创作于2023年2月蛋白质处于等电点时，其导电率、渗透压、粘度以及溶解度等性质均达最低值，通常利用蛋白质在等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质对某一蛋白质而言，当在某一pH值时。其所带正负电荷恰好相等，这一pH值就称为蛋白质的等电点定义2.蛋白质的等电点蛋白质在不等于其等电点的溶液中也会带电荷,并向相反电极移动,因此电泳也可用于分离蛋白质.电泳方法是实验室、生产、临床诊断等来分离蛋白质和鉴定蛋白质纯度最常用的手段。第112页，课件共146页，创作于2023年2月二.蛋白质分子的大小蛋白质是大分子物质，分子量很大，从一万到几百万，因此用于小分子物质分子量的测定方法就不适用蛋白质分子量的测定方法可根据其化学组成测定或者利用蛋白质的某些理化性质来测定：分为化学组成法和物理化学法第113页，课件共146页，创作于2023年2月蛋白质具有亲水胶体的典型性质：半通透性，丁达尔现象，布朗运动蛋白质分子表面分布着亲水的R基，故蛋白质溶液是亲水胶体三.蛋白质的胶体性质凡质点大小在1～100nm范围内的分散系统就称为胶体,蛋白质分子的直径一般在2～20nm的范围内，所以蛋白质溶液是胶体溶液，第114页，课件共146页，创作于2023年2月由于蛋白质的分子量大，在溶液中形成的颗粒较大，因此不能透过半透膜。利用这种性质可以将蛋白质与一些小分子物质（如葡萄糖，无机盐）分开，这种方法叫透析。第115页，课件共146页，创作于2023年2月四.蛋白质的沉淀作用天然蛋白质总是保持稳定的亲水胶体状态，这种稳定性由两个因素决定:水化膜和电荷排斥作用欲使蛋白质沉淀，则必须破坏蛋白质的亲水状态,可以通过破坏蛋白质稳定性的两个因素:加入脱水剂破坏水化膜,改变溶液pH值达到等电点，或者加入电解质使蛋白质表面失去同种电荷，蛋白质分子就能聚集而沉淀第116页，课件共146页，创作于2023年2月在一定pH值下，同种蛋白质分子总是带相同的电荷，由于同性电荷互相排斥，蛋白质颗粒就不能聚集而沉淀蛋白质分子表面分布的极性基可结合一层水化膜.这层膜的存在可防止蛋白质因相互碰撞而聚集沉淀，保证了溶液的稳定性1.水化膜作用2.电荷排斥作用蛋白质溶液的稳定因素第117页，课件共146页，创作于2023年2月蛋白质的沉淀方法1.中性盐法盐析法是最常用的分离蛋白质的方法。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍可保证蛋白质的活性。加入高浓度的中性盐，可降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏了蛋白质分子表面的水化层，同时同时中性盐完全电离产生的离子又中和了蛋白质的电荷，因此使蛋白质产生沉淀。这种方法叫盐析。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。第118页，课件共146页，创作于2023年2月

可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。2.有机溶剂法常温下有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备蛋白质。调节蛋白质溶液至等电点时，加入有机溶剂可加速蛋白质沉淀。第119页，课件共146页，创作于2023年2月当溶液pH值高于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，它易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）结合成不溶性盐而沉淀。3.重金属盐沉淀蛋白质重金属沉淀的蛋白质常是变性的，误食重金属盐后可大量饮用牛奶或豆浆等蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。第120页，课件共146页，创作于2023年2月pH小于等电点时蛋白质带正电荷，易与带负电（酸根阴离子）的生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)生成不溶性盐而沉淀。用此类方法沉淀的蛋白质常是变性的4.生物碱试剂和某些酸类沉淀蛋白质血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。第121页，课件共146页，创作于2023年2月将接近于等电点的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固而沉淀。5.加热凝固加热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。第122页，课件共146页，创作于2023年2月定义当天然蛋白质受到某些物理或化学因素影响后，由氢键、盐键等次级键维系的高级结构遭到破坏，分子内部结构发生改变，致使其生物学性质、物化性质改变，这种现象称为变性五.蛋白质的变性作用

因此变性是由于二级结构以上的空间结构发生改变或破坏所致（即氢键被破坏）。变性并不引起一级结构的破坏（肽键不被破坏），故蛋白质的组成成分及分子量不变第123页，课件共146页，创作于2023年2月这些引起蛋白质变性的因素常用于杀菌消毒,同时在制备、保存酶制剂及其他活性蛋白时，则要防止蛋白质变性五.蛋白质的变性作用变性的因素1.物理因素：加热、脱水、紫外线、x-射线、超声波以及剧烈搅拌2.化学因素：强酸、强碱、尿素、浓乙醇、三氯醋酸、去污剂、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等试剂第124页，课件共146页，创作于2023年2月3.溶解度降低:变性后原先藏于分子内部的疏水基团外露，加上蛋白质结构松散易聚合,因此溶解度降低形成沉淀变性蛋白质的性质1.生物活性降低或丧失:由于蛋白质变性后氢键被破坏,改变了空间结构,因此丧失生物活性4.产生新的颜色反应:一些原先藏于分子内部的侧链基团在变性后外露,使得蛋白质产生新的颜色反应五.蛋白质的变性作用2.易于被酶水解:蛋白质变性后分子结构伸展松散，因此，易被蛋白酶水解，这就是熟食易于消化的道理第125页，课件共146页，创作于2023年2月第126页，课件共146页，创作于2023年2月六.蛋白质的颜色反应蛋白质的某些氨基酸可与多种化合物作用产生各种颜色反应,这些反应可作为蛋白质的定性定量测定其中双缩脲反应是蛋白质的定性反应,可用于鉴别蛋白质第127页，课件共146页，创作于2023年2月试剂

反应基团颜色

鉴定用途双缩脲反应NaOH,CuSO4肽键紫红色所有蛋白质黄色反应浓HNO3

苯环黄色苯丙氨酸酪氨酸Millon反应HNO3HgNO3

酚基红色酪氨酸,酪蛋白乙醛酸反应乙醛酸吲哚基紫红色色氨酸茚三酮反应茚三酮自由氨基及羧基兰色所有蛋白质坂口反应：α-萘酚,次氯酸钠胍基红色精氨酸蛋白质的颜色反应第128页，课件共146页，创作于2023年2月+NH3双缩脲反应：双缩脲是两分子尿素经加热放出一分子水而得到