抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）检测标准操作规程

抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)检测标准操作规程××医院检验科临床免疫室作业指导书文件编号:XXX生效日期：共页第页1.目的规范检测血清或血浆中抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)的流程，确保检测结果的准确性及重复性。2.原理间接免疫荧光法：将稀释的血清与生物载片(反应区内固定有包被基质的生物薄片)温育，如果样本是阳性的，特异性IgG、IgA和IgM抗体与相应的核抗原结合。在第二次温育时，荧光素标记的抗人抗体与结合在生物基质上的抗体反应，形成荧光显微镜下所观察到的特异性荧光模式。3.标本要求3．2·样品收到后立即分离血清，不能及时测定的血清应于2~8℃保存。4.试剂与仪器5.操作步骤 (PBS)吐温缓冲液；待测血清样本用PBS吐温缓冲液1∶10稀释。5．2·加样：将加样板放在泡沫板上，将25μl稀释后的血清样本加至加样板的每一反应生气泡。5．3·温育：将生物载片有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，室温(18~25℃)5．4·冲洗：用盛于烧杯内的PBS吐温缓冲液冲洗载片，然后立即将生物载片浸入装有PBS泡至少5min。5．5·加样：将20μlFITC标记的抗人IgG(荧光二抗)加至洁净加样板的反应区上。5．6·第二次温育：从洗杯中取出生物载片，用吸水纸擦去背面和边缘的水分后，立即盖在加样板的凹槽里，室温(18~25℃)温育30min。5．8·封片：将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加封片介质至盖玻片，每一反应区约10μl。从洗杯中取出一张生物载片，用吸水纸擦干背面和边缘的水分。将生物载片有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上。6.校准定期对加样枪和荧光显微镜进行校准。关键部件更换或者维修后也需校准。7.质控每批次的实验应带上阴性和弱阳性质控物，滴度结果的在控规则：阴性质控物必须阴性，阳性质控物结果在上下1个滴度内。8.结果判断荧光模式：乙醇固定的粒细胞可区分出两种相关的ANCA(表所示)。胞浆型抗粒细胞胞浆抗体(cANCA)显示均匀分布在整个中性粒细胞浆中的颗粒型荧光，细胞核无荧光。主要靶抗原是中性粒细胞中嗜苯胺蓝颗粒内的蛋白酶3(PR3)。而核周型抗粒细胞胞浆抗体 (pANCA)在中性粒细胞核周显示光滑的带状荧光。主要靶抗原有髓过氧化物酶(MPO)、粒细胞特异性弹性蛋白酶、乳铁蛋白、溶菌酶等。抗蛋白酶3抗体在甲醇和乙醇固定的粒细胞显示相同的特异性荧光模式。通常抗MPO抗体在甲醇固定粒细胞上显示弱或无反应。表所示ANCA结果判读ANCA反应性结果1∶10无荧光反应滴度1∶10或更高血清中未检出该抗体血清中检出该核体注：以出现阳性核型的最高稀释度作为检测的结果。9.生物参考区间健康人血清或血浆中ANCA为阴性，滴度＜1∶10。10.性能参数血清检测的结果显示特异性荧光强度基本一致，阴性血清检测的结果为阴性。10．3·批间差异：用特征性血清对不同批号的产品进行检测，阳性血清检测的结果显示特异性荧光强度基本一致，阴性血清检测结果为阴性。11.临床意义11．2·cANCA主要见于韦格纳肉芽肿(WG)。活动性WG患者在病变尚未影响到呼吸系统时cANCA敏感性是65％，当患者已出现呼吸系统、肾脏损害时其敏感性达90％以上。少数尚未治疗的活动性WG患者cANCA阴性，但随着病情的发展，cANCA终将转为阳性。非活动性WG仍有40％cANCA阳性。其他的坏死性血管炎可出现pANCA。11．3·pANCA在快速进行性血管炎性肾炎、多动脉炎、ChurgStranss综合征阳性率70％，慢性自身免疫性肝炎阳性率80％。pANCA主要与多发性微动脉炎相关。pANCA的效价与疾病的活动性相关。11．4·溃疡性结肠炎、克罗恩病和