仪器培训荧光定量

仪器培训荧光定量第1页，课件共22页，创作于2023年2月PartI中心仪器简介PartII荧光定量PCR原理PartIII荧光定量PCR仪操作规程第2页，课件共22页，创作于2023年2月PartI中心仪器简介荧光定量PCR仪Rotorgene3000普通PCR仪GeneAMPSystem9700第3页，课件共22页，创作于2023年2月提供两种不同的转子36*0.2ml标准PCR管72*0.1ml金属锁环仅限于36孔转轮使用仅适用于平头0.2ml薄壁管PartI中心仪器简介第4页，课件共22页，创作于2023年2月首先，传统的PCR检测方法在测定PCR扩增产物前需打开反应管，容易造成产物污染，成为“假阳性”的主要来源。实时PCR在扩增过程中动态检测，完全以闭管方式进行，不仅操作简便，也杜绝了产物污染源。其次，传统PCR都是在PCR到达平台期后进行检测。PCR经过指数期后，对反应条件的变化十分敏感，扩增到达平台期的信号强度重现性很差。实时PCR方法则在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此具有重复性。PartII荧光定量PCR原理第5页，课件共22页，创作于2023年2月定量PCR技术的产生1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染料法插至双链DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度PCR循环=双链DNA=染料=荧光后来用与双链DNA有更强结合力的SYBRGreenI取代EBPartII荧光定量PCR原理第6页，课件共22页，创作于2023年2月PartII荧光定量PCR原理实时定量PCR技术是PCR技术和荧光检测技术的结合通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控PCR反应过程，通过仪器和相应的软件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。第7页，课件共22页，创作于2023年2月荧光定量PCR标记方法内掺式染料

SYBRGreenI序列特异性探针

Taqman MolecularBeacons

FRET引物特异性探针 Amplifluor(Intergen)PartII荧光定量PCR原理第8页，课件共22页，创作于2023年2月SYBR-GreenI

dsDNA的内插染料是一种能插入到双链DNA并发出强烈荧光的化学物质，其荧光强度的增加与dsDNA的数量成正比。如SYBRGreenⅠ染料，当它没有结合上双链DNA时，只发出相对弱的荧光；然而，当它一旦插入到双链DNA里时，荧光信号将会强烈地增加，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加。PartII荧光定量PCR原理第9页，课件共22页，创作于2023年2月5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

第10页，课件共22页，创作于2023年2月5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

第11页，课件共22页，创作于2023年2月5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

PartII荧光定量PCR原理第12页，课件共22页，创作于2023年2月5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

PartII荧光定量PCR原理第13页，课件共22页，创作于2023年2月双标记探针（TaqmanProbe）

5’端标记荧光分子（如：FAM），在3’端标记一个吸收或淬灭荧光的分子（如：TAMRA），这样5’端激发出的荧光会被3’端的分子淬灭或吸收掉，所以开始时，仪器并不能检测到荧光。由于Taq聚合酶同时具有5’端外切酶的活性，在PCR反应的延伸阶段，Taq酶会把5’端的荧光分子切下，使其与3’端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR产物扩增量的增加。PartII荧光定量PCR原理第14页，课件共22页，创作于2023年2月RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitationPartII荧光定量PCR原理第15页，课件共22页，创作于2023年2月1、配备36孔和72孔转子，根据实验需要更换。2、非实验孔用空管填满，以保证绝对的温度均一性。3、每次放好样品管后，开始实验前要用压环将样品管盖（平头管盖）压住。0.2mlPCR管PartIII荧光定量PCR仪操作规程第16页，课件共22页，创作于2023年2月开机操作：打开电脑等待导入WindowsXP系统打开Rotor-Gene3000主机电源，等待出现Ready状态提示。打开Rotorgene3000的盖子，将PCR反应管放入反应仓中，用空管填满反应仓。加上金属锁环（36孔），合上盖子。注意事项：

务必在转轮中填满管子，不反应的位置用空管代替，以保证热反应系统内部结构的均一性如果使用的是0.1ml的管子，在空管处拔掉帽子。如果使用的是0.2ml的管子，必须使用平头管子。PartIII荧光定量PCR仪操作规程第17页，课件共22页，创作于2023年2月软件使用流程：双击软件图标，进入控制软件Rotor-Gene6点Performlastrun,new点36-wellRotor,并选中NoDomed0.2mlTubes前面的复选框，点next设定自己的反应体系，点next点Editprofile,按自己预实验的每个基因的最佳条件设置hold和cycling,设好后点OK.点next,点StartRun,将当次实验保存至自己的文件夹中。PartIII荧光定量PCR仪操作规程第18页，课件共22页，创作于2023年2月关机操作：实验结束后，关闭电脑程序，关闭Rotorgene3000电源，电脑关机。系统设置注意：不要关掉硬盘，确保永不关掉硬盘。系统不能处于待命状态，确保永不进入待命状态。不能安装屏幕保护PartIII荧光定量PCR仪操作规程第19页，课件共22页，创作于2023年2月仪器维护：保持镜头的清洁，防止灰尘累积。加热舱朝下看，你会发现有一个（多通道机型）或两个（两通道）圆形透镜，他们是不同通道的检测物镜，如果通道上积累了灰尘或碎片，用棉签沾酒精清洗。在机器不用时，盖好舱盖以减少落入的灰尘。PartIII荧光定量PCR仪操作规程第20页，课件共22页，创作于2023年2月1.RotorGene3000荧