华理微生物课件

第六章微生物的生长及其控制1.微生物生长的测定2.

细菌的群体生长繁殖3.

微生物生长繁殖的控制微生物生长的常规测定方法（原理和操作）细菌生长繁殖的规律（标准生长曲线）及控制技术（连续培养的概念与方法）各种常见物理、化学因素对微生物生长的影响生长(growth)：个体体积或重量的变化繁殖(reproduction)：个体数量的变化个体生长fi

个体繁殖fi

群体生长群体生长＝个体生长＋个体繁殖衡量群体生长的量： 生长量，繁殖数什么是生长和繁殖1.纯培养的分离法自然界中的微生物都是杂居在一起的，每种微生物的生长情况是不同的。稀释平皿法纯种分离平板划线分离法利用选择培养基分离法单细胞挑取法第一节

测定生长繁殖的方法2.1

测定生长量测体积称干（湿）重菌丝长度测定法比浊法生理指标法：测含氮量测含碳量测磷、DNA、RNA、ATP商业上测定生长量的方法生理指标法，电阻抗法，微量量热法，放射法2.微生物生长的测定-生长量和繁殖数微生物快速检测设备-奥地利sy-Lab，Bactrac微生物快速测定（ATP）血球计数法（活细胞计数）平板活菌计数法（试剂纸法）菌落形成单位(cfu,

colonyforming

unit）膜过滤法自动计数法稀释摇管法微生物生长的测定－2.2

测细胞的个数比浊法turbidity血球计数法又被称为Petroff-Hausser

counting。平板活菌计数法平板活菌计数法的两种策略——涂布和倾注TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)纸片法膜过滤法——用于较稀溶液的计数方法膜过滤法生长曲线同步生长连续培养第二节

微生物的生长规律细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。四个阶段：延滞期(lag

phase)指数期(exponential

phase)稳定期(stationary

phase)衰亡期(decline

phase,

death

phase)1.典型生长曲线(growth

curve)生长曲线中各时期的细胞变化情况延滞期(lag

phase)将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。

细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大；

细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。

对外界不良条件反应敏感。以上特征说明细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓。在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。迟缓期出现的原因：微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏足够的能量和必需的生长因子，种子老化（即处于非对数生长期）或未充分活化，接种时造成的损伤等。调整代谢需要一段适应期迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。在生产实践中缩短迟缓期的常用手段(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；(2)利用对数生长期的细胞作为种子；(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；(4)适当扩大接种量指数期(exponential

phase)特点生长速率常数最大；代时(generation

time)最短；细胞平衡生长；酶系活跃，代谢旺盛。作为发酵生产的良好种子，可缩短延滞期。几个概念生长速率常数(growth

rateconstant):每小时分裂的代数R代数代时细菌培养基温度(℃)代时(min)漂浮假单胞菌肉汤379.8大肠杆菌肉汤3717蜡状芽孢杆菌肉汤3018嗜热芽孢杆菌肉汤5518.3乳酸链球菌牛乳3726蕈状芽孢杆菌肉汤3728霍乱弧菌肉汤3721～38金黄色葡萄球菌肉汤3727～30枯草芽孢杆菌肉汤2526～32巨大芽孢杆菌肉汤3031嗜酸乳杆菌牛乳3766～87褐球固氮菌葡萄糖25240大豆根瘤菌葡萄糖25344～461结核分枝杆菌合成37792～932梅毒密螺旋体家兔371980稳定期(stationary

phase)营养物质消耗，代谢产物积累、pH变化→→→→逐步不适宜于细菌生长→→→生长速率降低直至零（即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。稳定期到来的原因：营养物比例失调；积累了有害代谢产物；理化条件不适宜。特点：生长速率常数为零；菌体产量达最高点；细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物，芽孢杆菌开始形成芽孢，积累次级代谢产物。生产上延长稳定期的方法：补充营养物质（补料）或取走代谢产物、调节pH、调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或振荡获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物与稳定期相关的几个概念初生代谢物(primary

metabolites)

次生代谢物(secondary

metabolites)

稳定期产物(idiolites)菌体生长期(trophophase)代谢产物合成期(idiophase)衰亡期decline

phase;

death

phase营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。特点：细菌代谢活性降低；

细菌衰老并出现自溶；产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应如何利用生长曲线指导生产种龄：利用对数生长期的种子；延长稳定期；确定放罐时间。采用活菌计数比较麻烦，必需严格操作，否则不易得到准确的结果，重复性也差，在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。2.同步生长(synchronous

growth)同步培养(Synchronous

culture)：使群体中的细胞进行同步生长培养技术群体细胞能处于同一生长阶段，同时进行分裂的生长。同步生长：通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物生理与遗传特性的研究；工业发酵的种子；同步培养物：一种理想的材料机械方法离心方法

过滤分离法硝酸纤维素滤膜法环境条件控制技术温度培养基成份控制其他（如光照和黑暗交替培养）获得同步培养物的手段同步生长的生长曲线3.微生物的连续培养单（分）批培养(batch

culture)密闭培养(closedculture)将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。连续培养(continuous

culture)开放培养(openculture)在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。连续培养系统——恒化器(chemostat)连续培养系统——恒化器(chemostat)使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。恒化连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，以作为限制性因子，而其他营养物均过量。（细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度，并低于最高生长速率）限制性因子必须是机体生长所必需的营养物质，如氨基酸和氨等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，因而可在一定浓度范围内能决定该机体生长速率。恒化器(chemostat；bactogen)通过控制流速可以得到生长速率不同但密度基本恒定的培养物恒浊器恒浊连续培养测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；恒浊器(turbidostat)改变培养基的流速，以控制菌的浓度恒定。微生物在恒浊器中始终以最高的生长速率进行生长。用于获得大量菌体、与菌体生长相平行的代谢产物的生产。一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业单级和多级连续培养器单级连续培养器(one-stepcontinuous

fermentor)：代谢产物的生产速率与菌体生长速率平行。多级连续培养器(multi-stepcontinuous

fermentor)：代谢产物的生产速率与菌体生长速率不平行。连续发酵(continuous

fermentation)连续培养用于生产实践时，就称为连续发酵。连续培养的优缺点优点：高效、便于自动控制、产品质量稳定。缺点：菌种易退化、易污染杂菌、培养基利用率低。补料分批发酵补料分批发酵也叫半连续发酵、半连续培养，流加发酵（

fed-batchfermentation），它是以分批培养为基础，间歇或连续地补加新鲜培养基的一种发酵方法。第三节影响微生物生长的主要因素温度氧气

pH值温度生长曲线不同微生物的温度生长曲线从左到右：极度嗜冷微生物、嗜冷微生物、嗜温微生物、嗜热微生物、极度嗜热微生物氧气对微生物生长的影响按氧气需求划分微生物：专性好氧菌(strictaerobe)兼性厌氧菌(facultative

aerobe)微好氧菌(microaerophile)耐氧菌(aerotolerant

anaerobe)厌氧菌(anacerobe)Oxygen

for

growth微生物对氧的不同耐受能力的解释好氧生物因为有SOD，因此剧毒的超氧阴离子自由基（O2•－）被歧化成毒性稍低的H2O2，在过氧化氢酶的作用下，H2O2再变成无毒的

H2O。用于厌氧菌培养的厌氧手套箱及培养箱pH对微生物生长的影响pH最适pH最低pH最高pHpH的影响机理：影响营养物的离子化程度影响环境中有毒物质对微生物的毒性影响代谢反应中各种酶的活性第五节 有害微生物的控制控制（有害）微生物的生长速率或消灭不需要的微生物，在实际应用中具有重要的意义。抑制(Inhibition)：生长停止，但不死亡；化疗(Chemotherapy)：杀死或抑制宿主体内的病原微生物；消毒(Disinfection)：杀死或灭活病原微生物（营养体细胞）；灭菌(Sterilization)：杀死包括芽孢在内的所有微生物；物理杀菌因素的代表——温度利用高温杀菌：干热灭菌焚烧灭菌干烤灭菌(160-170,2h)灼烧灭菌湿热灭菌煮沸消毒法高压蒸汽灭菌法间歇灭菌法巴斯德消毒法高压蒸汽灭菌锅加水直接接触饱和水蒸气蒸汽流动畅通排尽冷空气缓慢减压压力为0时再打开，注意安全物理杀菌法－射线辐射灭菌(Radiation

Sterilization)是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。用于灭菌的电磁波有微波，紫外线(UV)、X-射线和γ-射线等由图可见波长为230－300nm的紫外线有杀死微生物的能力，但紫外线的穿透能力低，所以仅用于表面消毒和空气的消毒。除紫外线外，也可利用0.06-0.14nm的X射线或由Co60产生的γ射线进行灭菌。物理杀菌法－过滤除菌法利用过滤方法阻留微生物，也可达到除菌的目的，这就是过滤除菌法。此法适用于澄清液体和气体的除菌。工业上常用过滤法大量制备无菌空气，供好氧微生物的培养过程使用。对于一些不耐热的物料如氨基酸、维生素等也可以用微滤除菌。化学杀菌剂或抑菌剂－1.表面消毒剂重金属盐类：红汞有机化合物(酚类、醇类、酸类、醛类)氧化剂：卤素及其化合物，过氧化物表面活性剂：新洁尔灭肥皂染料：龙胆紫气体：环氧乙烷液化学物质的抗生物能力的测on体培养法centrati微

最低抑制浓度（minimum

inhibitory

con定

（MIC））实验平板培养法抑菌圈（zone

of

inhibition）试验六氯酚苯基苯酚氯季铵化合物在临床上最早使用的消毒剂----石炭酸灭菌方法原理及条件特点适用范围火焰灭菌法利用火焰直接把微生物杀死方法简单、灭菌彻底、但适用范围有限适用于接种针、玻璃棒、试管口、三角瓶口、接种管口等的灭菌干热灭菌法利用热空气将微生物体内的蛋白质氧化进行灭菌灭菌后物料可保持干燥，方法简单，但灭菌效果不如湿热灭菌适用于金属或玻璃器皿的灭菌湿热灭菌法利用高温蒸汽将物料的温度升高使微生物体内的蛋白质变性进行灭菌蒸汽来源容易、潜热大、穿透力强、灭菌效果好、操作费用低、具有经济和快速的特点广泛应用于生产设备与培养基的灭菌紫外线灭菌法用射线对微生物细胞进行灭菌使用方便。但穿透能力差，适用范围有限一般只用于无菌室、无菌箱、摇瓶间和器皿表面的消毒化学试剂灭菌法利用化学试剂对微生物的氧化作用和损伤细胞等进行灭菌使用方法较广，可用于无法用加热方法进行灭菌的物品常用于环境空气的灭菌及一些表面的灭菌过滤除菌法利用过滤介质将微生物菌体细胞过滤进行灭菌不改变物性而达到灭菌目的，设备要求高常用于生产中空气的净化除菌。少数用于容易被热破坏的培养基灭菌2.化学杀菌剂－抗代谢药物抗代谢药物：一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结构相似，