蛋白质的分离与纯化课件

第一章蛋白质的别离与纯化蛋白质别离纯化的一般原那么〔掌握〕分配层析的根本理论〔重点掌握〕蛋白质的层析别离技术离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等主要掌握操作要点及操作过程的本卷须知蛋白质的电泳别离技术不连续系统原理〔重点掌握〕SDS技术〔重点掌握〕、IEF〔一般了解〕蛋白质的浓缩〔了解〕第一节蛋白质别离纯化的一般原那么根据实验目的选择适宜的材料，应遵循：目的蛋白含量及生物活性尽可能高材料来源方便、本钱低、易操作可溶性及稳定性要尽可能好

材料的选择

注意：不同的生物体、不同生理状态、不同组织细胞的蛋白质含量和分布有很大差异

预处理：将不必要的结缔组织、脂肪组织等在尽可能接近生命状态下剔除，处理后应立即使用或在冷库中保存

细胞的破碎先要将细胞和组织破碎，使蛋白质充分释放出来

机械法匀浆：破碎机体软组织最常用方法之一组织捣碎：注意维持低温环境研磨：破碎单一细胞的有效方法，主要用于细菌、酵母等的破碎

物理法

超声法：输入高能超声波可以破碎细胞，破碎效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等在处理少量样品时操作简便、效率高，液量损失少，适于实验室使用注意:超声波产生自由基团和造成的溶液温度升高，可造成敏感的活性物质变性失活，另外噪声也比较大

反复冻融法：由于在此过程中易使活性蛋白失活，故适用于提取非常稳定的蛋白质

冷热交替法：绝大多数细胞被破坏，一般适用于从细菌或病毒中提取蛋白质

低渗裂解：是指无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解

化学法

有机溶剂法：有些有机溶剂(如苯、甲苯等)可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性的渗透出来外表活性剂(去垢剂)：常用的有十二烷基磺酸钠、TritonX-100、去氧胆酸钠等

酶解法：必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶特异、快速、精确、可重复、经济总蛋白含量蛋白质比活性〔specificactivity〕得率利用溶解度的差异别离盐析法：最经典的方法，常用来进行粗别离常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等，其中应用最广的是硫酸铵

影响盐析的因素很多，如pH、温度、蛋白质浓度等都会影响各种蛋白质的盐析点盐析硫酸铵沉淀有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而减少氨基酸侧链基团的解离，降低蛋白质分子外表电荷，使蛋白质分子聚集导致溶解度的降低；另外有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出温度：在一定温度范围内(0～40℃之间)，大局部球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加等电点法：当蛋白质处于等电点pH时，蛋白质的净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于凝集(aggregation)和沉淀(precipitation)，它的溶解度到达最低等电点沉淀根据分子量的不同别离

透析(dialysis)和超滤(ultrafiltration)：是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开平衡离心法：根据蛋白质分子大小、形状不同进行别离的技术凝胶过滤(gelfiltration)：又称分子筛层析(molecularsievechromatography)，这是根据分子大小别离蛋白质混合物的最有效方法之一透析过程根据电荷的不同别离电泳区带电泳：如醋酸纤维薄膜电泳，PAGE等

等电聚焦(isoelectricfocusing,IEF)

：具有更高分辨率的电泳技术

毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)：在细孔管或毛细管中进行电泳别离。柱效高、分析时间短，所用样品量及试剂消耗少，操作模式多，可以进行在线检测和自动化Agilent3DCE毛细管电泳系统离子交换层析

亲和层析亲和层析法可在温和条件下操作，纯化过程简单、快速、分辨率高，对别离含量少且性质不稳定的生物活性物质极为有效注意：应该尽量减少纯化步骤，缩短操作时间目的：防止目的蛋白的变性，保证其生物活性

缓冲液(buffer)

盐、金属离子和螯合剂

复原剂

去垢剂

(detergent)

蛋白酶抑制剂

蛋白质的环境因素第二节层析的根本理论1906年M.Tswett

AdsorptionChromatography1941年MartinandSynge

PartitionChromatography

PlatetheoryRatetheory假设有两种互不混溶的溶剂S和M，将A物质溶于一定量的S溶剂中，再参加一定量的M溶剂A物质在两相中相互扩散A物质在两相中到达了平衡(在同一时间内，进出两相的A物质的分子数完全相等)时，其分配系数为常数

一、分配定律CAS分配定律说明：一定的条件下，一定的物质其K值不变条件改变其K值随之改变K值大于1，物质在S相中的浓度大于其在M相中浓度CAM=K二、分配层析的机理假设有两种物质，在一定的条件下，它们的分配系数K不同，那么通过一根分配层析柱可以将它们别离。为了便于讨论，我们做如下几个假设：〔1〕层析柱可分成许多层，M是流动相，S是固定相，M和S是互不混溶〔2〕分配层析柱中，每一层左右相通，层与层之间互不相通，也就是说在层析柱中只有横向扩散而无纵向扩散

分配层析柱理论塔板示意图〔3〕在分配层析柱中，溶质在两相中到达分配平衡的速度很快，并且A物质的存在不影响B物质的分配性质，反之亦然〔4〕在该溶剂系统中，A和B两物质的分配系数分别设为：KA=CASCAM=1KB=CBSCBM=1/3如果在层析开始时，在第一层的S相中同时参加A和B两种物质，参加的量均为1。根据分配定律，M参加后，在两相中立刻进行分配，并且很快到达分配平衡。第一次分配前后A和B物质在S和M相中的量为：A和B物质在层析柱中1.分配10次；2.分配20次；3.分配30次二者之间总是存在着一定的偏差，这是因为：层析柱中总是或多或少地存在着纵向扩散层析过程不可能在绝对分配平衡的情况下进行

理论曲线和实际洗脱曲线是否相符？因此，通常实际的洗脱曲线都比理论曲线低而宽

Martin和Synge计算了硅胶柱的理论塔板数，求得一个理论塔板的高度为0.002厘米

Verzele计算为0.02厘米

1厘米的层析柱最少有50个理论塔板，那么，在一根20厘米的层析柱上最少可以进行1000

次分配。

一根分配层析柱上到底能进行多少次分配？塔板理论的要点：分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的在分配层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩散，而且在两相间到达分配平衡的速度很快体系中其他物质的存在不影响待别离物质的分配。待别离物质的存在也不影响其他物质的分配在分配层析柱上，物质在各个理论塔板中的含量可通过计算求得三、塔板理论第三节蛋白质的层析别离层析柱泵系统〔缓冲液〕检测器〔记录仪〕局部收集器液相层析的根本装置一、离子交换层析

(ionexchangechromatography)原理：利用生物大分子与具有相反电荷的离子交换剂之间相互作用不同而进行的别离

类型：阴离子交换剂(anion-exchangechromatography)

阳离子交换剂(cation-exchangechromatography)

样品的准备剂型的选择离子交换剂的预处理装柱(样品体积的2-5倍〕柱效应的标定上样洗脱

操作要点：

分步洗脱法(stepwiseelution)

梯度洗脱法(gradientelution)

目的蛋白的鉴定与回收离子交换剂的再生与储存离子交换层析原理：利用分子筛效应别离提纯具有生物活性的生物大分子物质二、凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)

凝胶的种类：

琼脂糖凝胶(Sepharose)

交联葡聚糖凝胶(Sephadex)

聚丙烯酰胺基葡聚糖凝胶(Sephacryl)样品的准备凝胶的选择与处理装柱〔L:W=50-100:1〕柱填充的检测上样〔1%-5%)洗脱目的蛋白的鉴定与回收层析柱再生与储存操作要点：

凝胶过滤层析的应用：脱盐蛋白质别离相对分子质量测定凝胶过滤用途蛋白质纯化蛋白质纯化后脱盐蛋白质分子量测定研究蛋白质寡聚体原理：利用生物大分子与其特异性配基的专一性识别和可逆性结合而建立起来的别离方法三、亲和层析

(affinitychromatography)改变大分子物质与配体之间的亲和力改变pH梯度

洗脱：亲和层析四、其它层析技术高效液相层析

(HPLC)疏水作用层析

(hydrophobicinteractionchromatography)反相层析

(reversedphasechromatography)第四节蛋白质的电泳分析一、定义(electrophoresis)

带电质点或颗粒在电场作用下向着与其电性相反的方向运动需要说明以下几点：

带电质点可以是带电的胶体颗粒、离子、甚至一些非极性的物质，只要其颗粒在胶体大小范围，在电场中也能向其相反方向运动

带电质点的净电荷与迁移率有关，带电性质决定其运动方向

生物体内的小分子，氨基酸、多肽、嘌呤、嘧啶及超过小分子的病毒、细胞器在电场中都能向与其电性相反的方向运动三、电泳的分类在溶液中进行的没有支持介质的电泳，也称移动界面电泳(movingboundaryelectrophoresis)自由电泳

(freeelectrophoresis)区带电泳(zoneelectrophoresis)

将应用支持介质的电泳称为区带电泳另一涵义：它表示在一个电场的作用下，在某一种支持介质上，能将一种混合物别离成假设干条区带(假设干组分)的电泳过程是带电的物质，都可采用某种电泳技术，别离成不同位置的区带，对区带可进行定性或定量分析样品用量少设备简单可在室温进行操作简便，消耗时间不多不同类型的电泳，有不同的用途改进或找到更好的支持介质，就有可能大大提高分辨率区带电泳只所以开展如此迅速，是由其本身的优点决定的：任意物质质点，由于其本身的解离作用或由于外表上吸附有其它带电质点，在电场中便会向一定的电极移动四、电泳的原理蛋白质分子：带电的性质和多少 pI

指带电质点或颗粒在单位电场强度下的泳动速度

五、电泳的迁移率M(mobility)2.公式：3.影响迁移率的主要因素：

带电颗粒的性质：即净电荷数量、颗粒大小及形状1.定义：

电场强度：指每厘米的电位降，也称电位梯度，或电势梯度

溶液的pH值：决定带电颗粒的解离程度，亦即决定所带净电荷的多少

溶液的离子强度：影响电动电位，缓冲液离子强度越高，电动电位越小，泳动速度越慢

电渗：在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正或负离子使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定的方向移动是一种利用人工合成的凝胶作为支持介质的区带电方法。RaymondS和WeinfraubL在1959年最早建立此方法。后来得到OrnsteinL和DavisRJ的推荐和开展，在1964年，他们又从理论上、实验技术上作了进一步的说明和改进后，才被推广使用六、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

机械强度好，有弹性透明，相对地化学稳定，对

pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的没有吸附和电渗作用.通过改变浓度和交联度，

可以控制孔径变化在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好由于纯度高及不溶性，还适合于少量样品的制备，不致污染样品1.聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备性能：

原料：丙烯酰胺(Acr)和亚甲基双丙烯酰胺(Bis)制备：催化剂：引发剂〔过硫酸铵,(NH4)2S2O8〕加速剂〔四甲基乙二胺,TEMED〕化学聚合和光聚合两种：

凝胶浓度和交联度：

不连续系统制备过程：TheseparatinggelpipettedintotheplasticcassettePreparationfortheSeparatingGel制备别离胶PipettingofwaterontotheseparatinggelCreatingtheStackingGelandWellsThestackinggelispipettedontopofthepolymerizedseparatinggel制备浓缩胶Beforethestackinggelpolymerizes,fullyinsertthecombintothetopoftheplasticcassette.

CastingthegelRemovetheplasticcombfromthegelcassettetoexposethewells加样Loadingsamplesintothewells

在不连续电泳系统中，含有三种离子，两种不同孔径的凝胶，两种或两种以上不同pH的缓冲溶液所谓不连续就是指凝胶浓度不一样，缓冲液离子成分，pH及电位梯度不一样

2.不连续系统原理概要在不连续电泳系统中，有三种物理效应，即样品的浓缩效应、分子筛效应及电荷效应由于这三种物理效应，使样品别离效果好，分辨率高凝胶层的不连续性：浓缩胶(stackinggel)别离胶(separatinggel)

缓冲液离子成分的不连续性：快离子(前导离子,leadingion)

慢离子(尾随离子,trailingion)

缓冲配对离子(缓冲抗衡离子,thebuffercounterion)

电位梯度的不连续性：在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的pH8.3Tris-甘氨酸缓