白腐真菌生物技术与应用课件

白腐真菌生物技术与应用环境工程专业选修课主讲教师胡长庆整理ppt课程安排与考核方式学时数32学时（包括讨论课时）白腐真菌生物学基础（理论基础）白腐真菌生物技术（应用基础）白腐真菌在环境保护中的作用（应用实践）考核方式闭卷考核成绩分配平时占40%；考核占60%整理ppt课程内容简介1白腐真菌生物学基础白腐真菌研究的历史、现状与未来白腐真菌生物学（概念、分类、特点、生物降解等）2白腐真菌生物技术包括白腐真菌的培养、分离、酶技术、固定化技术等3白腐真菌在环境保护中的作用白腐真菌与水污染控制白腐真菌与土壤污染控制白腐真菌与重金属污染白腐真菌与大气污染控制白腐真菌与有机固体废物资源化整理ppt1白腐真菌生物学基础白腐真菌研究的历史、现状与未来白腐真菌研究探索的历史

20世纪70年代至20世纪90年代白腐真菌研究繁荣的现状

以分子生物学为特征的理论研究白腐真菌研究发展的未来

以工业化应用为终极目标整理ppt白腐真菌生物学1、白腐真菌（WhiteRotFungi）的概念白腐真菌的概念不是生物学术语，而是一种功能描述的概念纤维素木腐真菌WoodRottingFungi木质纤维素Ligno-cellulose软腐真菌SoftrotFungi褐腐真菌BrownrotFungi白腐真菌WhiterotFungi木质素半纤维素多糖类软腐真菌：主要降解纤维素，对木质素降解缓慢且不彻底。褐腐真菌：主要降解纤维素、半纤维素和部分多糖类，几乎不降解木质素。白腐真菌：主要降解木质素和多糖类，对纤维素和半纤维素降解能力弱。整理ppt小结到底什么是白腐真菌？白腐真菌的概念是从功能角度对其进行描述和界定的白腐真菌是一类能够引起木质白色腐烂的丝状真菌主要降解木质素和多糖类，对纤维素和半纤维素降解能力弱白腐真菌嗜热性好氧微生物整理ppt2、白腐真菌的分类地位与主要种类2-1白腐真菌的分类地位生物界细菌古菌真核生物“生物三界学说”示意图根据16SrRNA碱基序列特点，整个生物界被划分为细菌（bacteria）、古菌（archaea）和真核生物（eukaryotes）3大超界（Domain）白腐真菌属于真核生物超界。木腐真菌已知的有1600～1700种，大多数是担子菌和子囊菌。软腐真菌：子囊菌、半知菌褐腐真菌：大部分属于担子菌白腐真菌：主要是担子菌，少数为子囊菌整理ppt2-2白腐真菌的主要种类已知白腐真菌种类有400多种，研究最为透彻，被称为白腐真菌研究模式菌种的是黄孢原毛平革菌（PhanerochaetechrysosporiumBurdsal）。黄孢原毛平革菌的生物学分类地位担子菌门Basidiomycota伏革菌科Corticiaceae非褶菌目Aphyllophorales层菌纲Hymenomycetes原毛平革菌属Phanerochaete门纲目科属黄孢原毛平革菌主要分布在北半球，其无性世代也被称为多粉侧孢霉（SporotrichumpulverulentumNovobranova）。整理ppt白腐真菌主要分布于8个菌属革盖菌属Coriolus原毛平革菌属Phanerochaete卧孔菌属Poria层孔菌属Fomes多孔菌属Polyporus烟管菌属Bjerkandera侧耳属Pleurotus栓菌属Trametes研究较多，且表现出较强降解能力的菌种有20种污色原毛平革菌丝核菌糙皮侧耳、平菇红孔菌变色栓菌、云芝韧革菌漏斗状侧耳、凤尾菇多孔菌毛栓菌短射脉菌裂褶菌、树花金孢霉菌烟管菌短孢射脉菌维氏针层孔菌拟蜡菌香菇、椎茸毛革盖菌木蹄层孔菌射脉菌整理ppt3、白腐真菌的生理特点白腐真菌是一个庞大的生物家族，各成员的生理特点会表现出很大的差异。笼统的谈白腐真菌的生理生化特征和性质，既不现实，也不准确。黄孢原毛平革菌黄孢原毛平革菌具有发达的菌丝体，菌丝常为多核，少有隔膜，无锁状联合。多核分生孢子常为异核，担孢子却是同核体。交配系统有同宗交配和异宗交配。黄孢原毛平革菌的生长具有营养生长期和子实体生长期。整理ppt

锁状联合：担子菌的次生菌丝每一个细胞都有二个核，其中一个核来自母本，一个来自父本，当双核细胞进行细胞分裂时，在二个核之间外生一个短小弯曲的分枝，核移动，在二核之间生出一个突起如钩状，一个核进入钩，一个留在菌丝。钩中保留一个核，一个往后移，菌丝中二个核一往前一个往后移钩状突起向下弯曲与细胞壁接触溶化，分枝基部生分隔膜（分隔中间有孔道），在原分支外形成一隔膜，产生一个新细胞双核体，在分隔处保留一个桥形结构。整理ppt分生孢子

无性繁殖，通过菌丝体的裂殖产生。担孢子

有性繁殖，必须通过菌丝体细胞的锁状联合过程。整理ppt同宗交配和异宗交配两条可互相交配的单核菌丝融合担孢子一次菌丝担孢子一次菌丝单核萌发二次菌丝双核二次菌丝担孢子······只要同一孢子萌发的单核菌丝间的互相结合生出双核菌丝后，就可形成子实体，这种现象称为同宗交配。反之，只有异性的单核菌丝（不同孢子），才能结合成双核菌丝，这种结合方式称为异宗交配。整理ppt3-1白腐真菌的生长与代谢特点（黄孢原毛平革菌）营养期初生生长白腐真菌繁殖期次生生长停滞期对数期细菌静止期生长是线性的，生物量显著增加。生长基本停滞，甚至发生生物量的下降。诱因：氮限制（nitrogenlimitation,N-L）碳限制（carbonlimitation,C-L）整理pptN-L在木质素降解中的作用:

实质上是白腐真菌在进化过程中对环境中氮缺乏的一种生理适应。C-L在木质素降解中的作用:

主要是它和菌丝体质量的减少像偶联，从而启动了次生代谢。与木质素降解有关的几个基本概念营养限制N-L和C-L木质素的降解木质素降解酶的合成要求木质素降解条件Ligninolyticcondition培养体系生理特征参与的酶木质素降解培养Ligninolyticculture木质素降解活性（木质素降解活动）Ligninolyticactivity木质素降解酶Ligninolyticenzyme整理ppt白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢(cometabolized)过程木质素完成降解过程白腐真菌？+生长底物Growthsubstrate白腐真菌共代谢的两种方式1、某种生物将一种底物转化，却无法在这种底物上生长，即生物体不能利用这种底物氧化所产生的能量去维持生长。2、一些生物为了共同的效应，共用其生物化学资源，协同作用，对化合物进行降解。白腐真菌降解木质素属于何种方式？整理ppt小结3-1白腐真菌的生长与代谢特点白腐真菌的生长具有营养生长期和子实体生长期。锁状联合分生孢子担孢子同宗交配异宗交配营养期白腐真菌生长是线性的，生物量显著增加；繁殖期（子实体体生长期）生长基本停滞，甚至发生生物量的下降。氮限制（N-L）碳限制（C-L）白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢过程共代谢的两种方式整理ppt3-2白腐真菌在培养中的特点（黄孢原毛平革菌）这里的培养特指实验室中小规模的,以研究基本规律为目的的培养接种物接种方式菌丝体孢子按干重或是湿重计量优点：能准确量化能保证碳、氮营养限制应用范围：基础研究和应用研究初期接种方式：制备孢子悬浮液（sporesuspension,SS）按培养基量成一定比例接入关键是接种物的定量整理ppt培养方式(实验室规模的一般性培养)按培养基的物理状态划分半固体培养体系固体培养体系液体培养体系静置培养Standingculture振荡培养Shakingculture整理ppt静置培养Standingculture固定台面孢子1-2天菌丝垫或菌垫Mycelialmat条件适宜10天左右……白色粉状物—孢子1、尽量采取浅层培养方式；2、尽量避免菌墊起褶，尤其在培养初期菌墊很薄的时候；3、氧气的扩散速度是静置培养时决定白腐真菌降解木质素能力的限制性因子；整理ppt振荡培养Shakingculture振荡培养仪器孢子1-3天菌丝团或菌团Mycelialpellets1、菌团的大小及数量随接种量和转速而变化：接种量大，菌团大；转速越大，菌团越小，数目越多；（100mL三角烧瓶→40mL培养液）2、一般而言，在100～200r/min条件下，菌团直径在3～5mm；3、主要为细菌系统建立的振荡培养技术，实际上并不适合直接应用于白腐真菌系统，主要是由于白腐真菌对振荡所产生的机械剪切力高度敏感；整理ppt固体培养体系白腐真菌的固体培养主要是平板培养，少量进行斜面培养。平板培养的目的：①扩大菌的生物量或是大量获得孢子；②鉴定菌的酶活性或扫描菌对化学物质的降解能力；③用于菌种的分离筛选、诱变、驯化或是短期的保藏；斜面培养的目的：菌种的中、长期保藏；孢子或菌丝体平板培养斜面培养数日数日气相生长气相生长菌丝层菌丝层气生孢子气生孢子整理ppt3-3环境因子对白腐真菌代谢活动的影响（黄孢原毛平革菌）白腐真菌环境因子培养参数的操作、调控和优化菌的代谢或降解潜能开发利用的关键建立一个合理的反应体系涉及的环境因子或培养条件包括：①培养基成分；②活性添加成分；③氧；④pH；⑤温度整理ppt培养基成分实验培养最佳碳源为葡萄糖碳源物质香草酸钠:支持菌的生长,也可支持木质素降解;葡萄糖酸钠:支持菌的生长,但是木质素矿化程度低于甘油和琥珀酸钠;葡萄糖酸内酯:支持菌的生长,但是木质素矿化程度低于甘油和琥珀酸钠;甘油:可当碳源也可能源,支持木质素降解,是筛选菌突变体的碳源;琥珀酸钠:可当碳源也可能源,支持木质素降解;葡萄糖:支持菌的生长,支持木质素矿化程度高;纤维素:支持菌的生长,支持木质素矿化程度极高;优劣整理ppt氮源物质营养氮源的种类对木质素降解的影响不大，重要的是氮源的浓度；氮丰富状态对木质素代谢会产生负面影响；铵类氮源会抑制一些酶的合成，产生“氨代谢物抑制”现象；维生素缓冲成分金属成分硫胺素是白腐真菌生长和木质素代谢的必须成分；乙酸钠、琥珀酸钠、酒石酸钠是三种最为常用的缓冲成分；主要功能，或作为一般的营养元素，或作为酶的结构组成和活性因子；整理ppt活性添加成分活性添加成分（activatedadditive）有利于提高或保护木质素降解系统，可以提高培养体系的反应性。VA（藜芦醇，3,4-二甲氧基苯甲醇）白腐真菌本身在生长过程中可以产生VA（次生代谢物），外源加入一定量的VA可以显著提高木质素过氧化物酶的合成及活性。芳族化合物起到氧化还原调节剂的作用，常见的有3,4-二甲氧基苯甲醇和3-羟基邻氨基苯甲酸盐。整理ppt有机酸表面活性剂有机酸，如甘醇酸（glycolate）、乙醛酸（glyoxylate）、草酸（oxalate）等，可以促进木质素降解活动。其中，草酸的作用尤其引起重视，草酸具有刺激锰过氧化物酶及调节细胞外酸碱度的功能。白腐真菌液体培养体系中加入表面活性剂可以有效地保护木质素降解酶免受因机械剪切力所造成的结构破坏或活性丧失。最为常用的表面活性剂Tween80（吐温80）整理ppt氧环境中氧的浓度对白腐真菌的生理代谢及木质素降解活动有很大影响。但是，绝对不能简单的认为是氧的绝对浓度问题，起关键作用的是白腐真菌真正所能获得的有效氧的多寡。pH白腐真菌生长所需的适宜pH为5.5左右，稍高于木质素降解所要求的最佳pH4.5。当培养体系pH低于3.5或是高于4.5的情况下，会显著抑制木质素的降解和降解酶系统的工作。温度白腐真菌生长扩增所需的温度范围在25～39℃，要求并不十分严格。整理ppt4、白腐真菌酶学简介4-1白腐真菌主要酶种概述H2O2产生酶系葡萄糖氧化酶乙二醛氧化酶甲醇氧化酶VA氧化酶其他酶其他酶系过氧化物歧化酶葡糖苷酶苯丙氨酸解氨酶还原脱卤酶系统醌还原酶芳烃硝基还原酶蛋白酶木质素氧化酶系需H2O2的过氧化酶漆酶Lac木质素过氧化物酶LiP锰过氧化物酶MnP白腐真菌木质素降解酶系统（ligninolyticenzymesystem）整理pptH2O2产生酶系共同作用：以小分子有机物为底物，将分子氧化还原为H2O2。葡萄糖氧化酶细胞内合成分泌到细胞外环境，将糖类物质氧化还原为H2O2。乙二醛氧化酶为细胞外的含铜氧化酶，主要以醛类物质为底物。而醛类物质恰好是葡萄糖氧化的中间产物。其他酶

参与H2O2的产生。主要有甲醇氧化酶，VA氧化酶等。整理ppt漆酶（Lac）木质素过氧化物酶（LiP）

能氧化高氧化还原电位的化合物，催化酚类、非酚类物质氧化，参与木质素解聚。锰过氧化物酶（MnP）

表现出对锰二价离子的绝对需要，氧化氧化还原电位相对低的化合物，如胺类、染料，在脱色反应中起主要作用，参与木质素解聚。木质素氧化酶系需H2O2的过氧化酶含铁的血红蛋白胞外酶含铜多酚氧化酶（对二酚氧化酶）以单酚、二酚、二胺、多酚类化合物为底物。对非酚类物质，特别是蒽、苯并芘，多环芳烃类作用显著。参与木质素的解聚和降解。整理ppt其他酶系过氧化物歧化酶

保护白腐真菌活细胞中过氧化物自由基免遭氧化压力；葡糖苷酶

具有糖基化的活性，在废水脱色中起着重要作用；苯丙氨酸解氨酶与VA的生物合成密切相关；还原脱卤酶系统

能还原卤素基团；醌还原酶能产生氢醌，对木质素及环境污染物的降解极其重要；芳烃硝基还原酶是硝基芳香族化合物降解的关键；蛋白酶具体情况尚不明确；整理ppt木质素过氧化物酶（LiP）的分离和检测LiP的分离4-2主要木质素降解酶的分离、提纯和检测方法LiP的粗制品液体培养细胞外液6天上清液12000～18000g离心10～30分钟去除菌丝和孢子粗酶液4℃保存24hDEAE树脂4℃，离子交换LiP的粗制品的纯化DEAE离子交换柱LiP的纯化制品NaCl梯度溶液洗脱整理pptLiP的标准检测方法基本原理藜芦醇（VA）藜芦醛（VAd）LiP催化H2O2320nm无吸收强烈吸收反应体系操作要点2mmol/LVA50mmol/L酒石酸（pH3.0～3.5）0.4mmol/LH2O2一定量的酶液H2O2使用前新鲜配制；30℃反应时间10分钟；pH保持在3.0～3.5；使用1cm石英比色皿，各比色皿总体积差额用蒸馏水补足；VA使用真空蒸馏或是在醚中萃取的方法进行纯化；整理ppt锰过氧化物酶（MnP）的纯化和检测MnP的纯化菌的培养液用玻璃棉过滤，获得粗过滤液超过滤法浓缩过滤物，使其浓度增加20倍用去离子水按1:1比例进行稀释使用DEAE阴离子交换柱吸附洗涤50mL蒸馏水20mmol/L酒石酸钠（含0.4mol/LNaCl）洗脱蛋白质超过滤法除盐或浓缩冰冻干燥，-20℃保存所有纯化步骤在4℃进行，通过上述方法制备的酶制品可以保存1年不失活整理pptMnP的基本测定方法利用各种芳香族底物，在补充锰（Ⅱ）离子的条件下，均可进行MnP的测定。表用于MnP测定的底物及相关波长数据底物波长/nm亚香草基丙酮3362,6-二甲氧基苯酚（DMP）568丁香酸260愈创木酚465姜黄素430丁香醛连氮525松柏醇263邻联（二）茴香胺460整理pptMnP的基本测定方法具体步骤1mL反应混合液0.1mmol/L酒石酸钠（pH5.0）0.1mmol/L底物0.1mmol/LMnSO4适量的酶液光程1cm、体积1.5mL石英比色皿，室温加入0.1mmol/LH2O2以不加H2O2的反应体系为对照；1U为每分钟氧化1微摩尔每升底物的MnP；启动反应MnP其他具有代表性的测定方法还包括ABTS氧化法，Mn(Ⅱ)氧化法和酚红法。整理ppt漆酶（Lac）的定性和定量检测方法Lac的定性检测方法Lac的定量检测方法愈创木酚法：在含0.02%（质量浓度）愈创木酚的平板上可以鉴定细胞外液中Lac的活性，Lac催化愈创木酚聚合形成红棕色的区带。1mmol/L愈创木酚50mmol/L乙酸钠pH4.5适量的酶液37℃，5分钟465nm处测定吸光度一个酶活单位定义为每分钟引起波长465nm处吸光度一个0.01单位变化所需的酶液量。整理ppt5、白腐真菌分子生物学简介黄孢原毛平革菌的分子生物学其他白腐真菌的分子生物学木质素降解过氧化物酶的分子生物学未来发展趋势：破解各类白腐真菌基因图谱整理ppt6、白腐真菌的生物降解6-1白腐真菌生物降解的特点非专一性nonspecific非水解性nonhydrolytic细胞外性extracellular白腐真菌能降解各种不同的化合物，具有广谱的底物范围。其对作用底物的结构和类型要求是高度非特异性的。白腐真菌在生物降解过程中并不出现通常的酶的水解反应。白腐真菌通过细胞外酶的作用对木质素类物质进行氧化分解。木质素的结构特征整理ppt6-2白腐真菌生物降解系统白腐真菌生物降解系统的概念营养限制N-L和C-L木质素的降解木质素降解酶的合成要求木质素降解条件Ligninolyticcondition参与的组分木质素降解系统Lignindegradationsystem,LDS白腐真菌生物降解系统泛指所有白腐真菌在适宜的条件下所形成的参与生物降解活动的组分的集合。整理ppt白腐真菌生物降解系统的组成酶组分小分子有机物白腐真菌生物降解系统产过氧化氢的酶过氧化物酶其他酶种VA草酸HAA3-羟基-邻氨基苯甲酸（氨茴酸）注意：1、葡萄糖氧化酶和乙二醛氧化酶的区别；

葡萄糖氧化酶是细胞内酶，乙二醛氧化酶为细胞外酶

2、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的异同点；

相同点：均在细胞内合成，分泌到细胞外，以H2O2为最初氧化底物，触发酶的催化循环；

不同点：Lip主要催化非酚类的芳香族化合物，只与木质素解聚有关，MnP主要催化酚类化合物，与H2O2产生和木质素解聚均相关；整理ppt白腐真菌生物降解系统的基本要求1、一种共底物，不能以木质素或是其他降解底物为唯一碳源；2、底物的不可诱导性；3、只在次生代谢期间得以表达；4、因碳、氮、硫等的限制而触发；5、能被一些化学物质所强烈抑制；6、对微量金属元素平衡的敏感；7、相对狭窄的酸碱度范围；8、明显地受氧气浓度的影响；整理ppt6-3白腐真菌生物降解的机制木质素的降解机制木质素的部分结构示意图木质素是由类苯丙烷亚单位非线性随机连接形成的天然生物聚合物。木质素主要前体物对豆香醇松柏醇芥子醇愈创木基木质素愈创木基丁香基木质素愈创木基丁香基对羟苯基木质素主要存在于草本植物中主要存在于裸子植物中主要存在于木本植物中木质素的主要种类整理ppt木质素的降解过程木质素脱甲基化羟基化芳环开裂白腐真菌细胞外酶愈创木基和丁香基亚单位甲氧基含量减少邻苯二酚脂肪羧酸水解1、侧链中：发生氧化形成羰基和羧基；2、芳环中：脱甲基化形成邻苯二酚后发生氧化开裂；3、环裂片段进一步被降解，释放出脂肪类产物和新的酚羟基单位，然后降解；4、侧链断裂与芳环开裂几乎同时发生；整理ppt化学物质的降解机制氧化机制包括LiP和MnP的过氧化物酶，利用H2O2促进化学物质发生单电子氧化形成自由基。氧化机制依赖MnP催化的氧化氧化机制类似于LiP的直接氧化，但表现出对Mn的绝对需要。依赖LiP的氧化直接氧化间接氧化被氧化化学物质不必与酶发生结合，氧化通过简单的电子传递而发生。主要氧化的化学物质为PAH类、氰化物和染料。依靠某种中介物（调节剂）相助进行氧化。主要氧化的化学物质为木质素、有机酸等。整理ppt还原机制白腐真菌对化学物质的降解过程中还原机制存在两种类型，一是依赖LiP的还原，一是依赖MnP的还原。脱毒机制有机化合物之所以能抵御生物降解是由于其毒性，能对生物造成毒效应。白腐真菌对化学物质的降解过程就涉及到其解毒机制。白腐真菌的解毒机制主要有两种，即酚类化合物的甲基化和化学物质依赖于细胞质膜的还原反应。整理ppt6-4白腐真菌生物降解的广谱性白腐真菌种类的多样性白腐真菌特殊的降解机制白腐真菌对广谱的化学物质具有敏感性和进攻性目前白腐真菌可以有效降解的具有代表性的化学物质大类共有16类单苯化合物苯、甲苯、乙苯和二甲苯（分别简称为B、T、E和X，合称BTEX），是一类重要的有机污染物。白腐真菌对这类有机污染物质的降解效果，从底物的敏感性来排序：E＞T＞X＞B（乙苯＞甲苯＞二甲苯＞苯）整理ppt氯苯氯苯是优先污染物，作为溶剂、脱脂剂、甜味剂和各类农药，染料合成的中间体被广泛使用。白腐真菌对这类有机污染物质的降解效果，按照降解速率来排序：单氯苯＞间二氯苯＞邻二氯苯＞对二氯苯苯胺主要是降解3,4-二氯苯胺（DCA）。氯酚氯酚是污染物的大类，也是造纸废水的主要成分。白腐真菌主要降解五氯苯酚（PCP）、单氯苯酚（CP）、二氯苯酚（DCP）和三氯苯酚（TCP）。整理ppt联苯联苯类物质由于疏水性和稳定性，在环境中可以长期存在，对人及各种生物构成毒性。白腐真菌主要降解多氯联苯（PCB）和联苯。硝基芳烃化合物硝基芳烃化合物是合成许多工业化学物质的重要原料。白腐真菌主要降解2,4,6-三硝基甲苯（TNT）和2,4-二硝基甲苯。杂环化合物杂环化合物大多数属于雌性荷尔蒙类物质，对人体危害极大。白腐真菌主要降解噻嗯类和二恶英类。整理ppt氰化物氰化物是优先污染物，作为LiP的一种底物，在H2O2存在时，能被白腐真菌迅速矿化为CO2。杀虫剂白腐真菌主要降解DDT和有机磷杀虫剂。除草剂白腐真菌主要降解2,4,5-三氯苯氧乙酸。整理ppt卤化物白腐真菌对于有机类卤化物具有脱卤作用。塑料及聚合物白腐真菌主要降解木素-聚苯乙烯接枝共聚物，聚乙烯塑料和聚酰胺。挥发性有机物白腐真菌对9种在排放的工业废气中普遍存在的挥发性有机物（VOC）具有降解能力。包括芳烃类（苯、甲苯、乙苯、苯乙烯）、酮类（甲乙基酮、甲基异丁基酮、甲基丙酮）、有机酸类（乙酸丁酯、乙基-3-乙氧基-丙酸酯）。整理ppt煤主要是针对低级煤（LRC），对其进行液化、解聚、聚合和脱色。PAH多环芳烃（PAH）是重要的环境污染物，危害极大。白腐真菌主要降解蒽油、芘、苯并芘、蒽、菲等PAH类物质。染料白腐真菌主要降解偶氮染料、三苯甲烷染料、聚合染料、杂环染料和靛类染料，几乎包括了染料的所有大类。整理ppt6-5白腐真菌生物降解的优点白腐真菌的生物降解具有其他生物体系，尤其是细菌体系，所不具备的优点，共有六大优势。1、不需要进过特点底物的预条件化；2、动力学优势；3、对其他微生物的拮抗；4、细胞外的降解特征；5、降解底物的非特异性；6、适用于固液两种体系；整理ppt6-6白腐真菌生物降解的意义白腐真菌在碳素循环中的地位和作用白腐真菌是生物修复的有力工具白腐真菌在物质转化和资源利用中的应用分解作用光合作用有机碳微生物动物植物死亡死亡生物圈岩石圈埋葬有机碳大气圈/土壤圈/水圈CO2呼吸作用CO、CH2CH4沉积作用CaCO3和MgCO3矿物染料燃烧CO2和CO；岩石风化CO2碳素循环（生物和地质循环）示意图整理ppt白腐真菌生物技术白腐真菌生物技术体系基础性技术体系应用性技术体系以白腐真菌的生长繁殖、培养保存等为主；以白腐真菌的生活史为线索以白腐真菌的分离诱变、反应体系的建立等为主以菌的生理生化为线索白腐真菌生物技术的特点：1、复杂性：条件的复杂性以及调控和操作的复杂性；2、综合性：生物学问题、化学问题和环境问题的结合；整理ppt1、白腐真菌培养技术白腐真菌生长及保存培养基液体培养基平板培养基试管培养基保存培养基生长培养基几点说明：①培养基的pH值，一般保持在5.5左右；②将固体培养基分装在试管里，做成斜面，主要供菌种保存用；③将固体培养基倾入培养皿，制作平板，主要供菌种扩增和获得分生孢子、菌琼脂块等接种物；④不加琼脂，即配制成液体生长培养基，主要为菌种的扩增和获得收集菌丝体用；整理ppt主要培养基种类PDA培养基这是培养真菌生长的经典固体培养基，全称土豆葡萄糖琼脂培养基（potatodextroseagar,PDA）。配方（L-1）：200g土豆浸出液，3gKH2PO4，20g葡萄糖，20g琼脂，1.5gMgSO4·7H2O。MEA培养基这是以麦芽汁为主要成分的固体培养基，全称麦芽琼脂培养基（maltextractagar,MEA）。配方（L-1）：30g麦芽浸膏，3g大豆蛋白胨，15g琼脂

。MEG培养基配方（L-1）：5g麦芽浸膏，10g葡萄糖，10g琼脂

。YMPG培养基主要由酵母抽提物，麦芽汁，蛋白胨和葡萄糖组成。配方（L-1）：10g麦芽汁，2g蛋白胨，2g酵母抽提物，10g葡萄糖，20g琼脂，1gMgSO4·7H2O，2gKH2PO4。整理ppt促进白腐真菌生长的天然成分木材、玉米芯、土豆浸出液是目前比较常用的促进白腐真菌生长的天然成分。菌种的保存菌丝块或孢子室温或28℃或35℃至39℃下培养5～7天，-20℃或4℃保存孢子混合硅胶密封4℃保存斜面保存孢子悬浮液保存孢子的硅胶保存孢子-20℃或4℃保存无菌蒸馏水整理ppt接种物的制备孢子悬浮液的制备孢子无菌蒸馏水或0.5%（质量浓度）的Tween80溶液培养过滤玻璃棉稀释孢子悬浮液孢子悬浮液浓度测定血球计数板计数（浓度测定的直接方法）分光光度法（浓度测定的间接方法）孢子悬浮液制备过程示意图整理ppt琼脂块

主要是那些不形成分生孢子的菌种的接种物。

方法：从生长旺盛的平板边缘，切割0.5～1.0cm见方的琼脂块。菌丝体菌丝体洗涤研磨混合1min取出液体培养体系液体培养基菌丝体悬浮液确定生物量湿重计算法干重计算法菌丝体悬浮液制备方法示意图孢子活力的测定使用美蓝染色法测定白腐真菌分生孢子的存活率。整理ppt2、白腐真菌的分离技术2-1木腐担子菌的分离与筛选技术步骤：担子菌筛选→鉴定菌的木质素降解能力技术核心：从自然环境的固体介质的混合微生物群体中，将木腐或白腐担子菌分离筛选出来。基本思路：建立选择培养基，在固体的分离培养基中加入一些对其他类别微生物的抑制剂。基本步骤：担子菌的筛选担子菌的纯化具体菌种的纯化担子菌的分离整理ppt以黄孢原毛平革菌的分离为例担子菌的筛选利用选择培养基初步分离担子菌类（粗筛）常用选择培养基配方干燥的麦芽汁提取物3.0g真菌蛋白胨0.5g琼脂2.5g蒸馏水100mL邻苯基苯酚0.006g注意点：1、邻苯基苯酚的浓度可以根据具体情况进行调节，最大浓度≤0.01%（质量浓度）；2、使用乳酸调节培养基pH值，不影响对担子菌的筛选；优点：能从受霉菌严重污染的土壤及其他介质中分离担子菌；真菌耐药性试验细筛利用担子菌对各类天然和合成杀真菌物质的忍耐性，进一步从筛选体系中去除可能残留的细菌和放线菌。常用的杀真菌物质为玫瑰红（四碘四氯荧光素），一般使用浓度30mg/L。整理ppt担子菌的纯化使用苯菌灵-麦芽琼脂培养基对培养物进行进一步培养（纯化）纯化的目的：是要去除培养物中可能存在的其他丝孢菌类（hyphomycetes）；苯菌灵母液的配制：1g的50%苯菌灵粉末，加到500mL的蒸馏水中；一般使用浓度与方法：将母液按照1mg/L的浓度加入2%（质量浓度）的麦芽琼脂培养基中；担子菌的分离以PolyR-478为指示剂分离能降解木质素的菌种（分离）常用分离培养基配方大麻茎木0.2%（质量浓度）琼脂1.5%（质量浓度）苯菌灵15mg/L愈创木酚0.01%（质量浓度）分离使用0.02%（质量浓度）含PolyR-478（聚合染料）的平板麦芽琼脂培养基培养分离菌种检定使愈创木酚变成褐色的菌为目标菌种使含PolyR-478的平板麦芽琼脂培养基脱色即可确认分离成功整理ppt具体菌种的纯化根据需要筛选的特定菌种类型，使用与之匹配的选择性分离培养基，对培养物反复多次培养，直至获得目标纯菌种，然后采用16sRNA检测鉴定。问题假设已经获得某种白腐真菌的子实体，可以采取何种方法分离出纯菌种？培养各类真菌子实体切割获取子实体块PDA培养基植入获得菌丝体菌丝体纯培养整理ppt2-2具有降解异生物质能力的白腐真菌的筛选筛选的必要性白腐真菌对异生物质的降解长期以来集中在黄孢原毛平革菌，但是在实际应用过程中其木质素降解条件很难得到满足。因此，筛选能在较宽泛环境条件下降解异生物质的白腐真菌对于应用技术的开发具有重要意义。筛选的基本策略理想的筛选方法，既要便宜，建立在相对无毒的底物基础上，不依赖于烦琐的分析之上，同时它应该与木质素降解酶所调节的异生物质的降解有高度的相对应性。利用聚合染料的筛选程序（常用）指示染料的选择选择培养基异生物质的降解与染料脱色相关性判断整理ppt2-3白腐真菌木质素降解性能的鉴定白腐真菌木质素降解酶的平板定性方法一PolyR-478指示细胞外氧化酶在平板上补充0.02%（质量浓度）PolyR-478，用于检测细胞外氧化酶。现象：平板脱色方法二平板系统定性测试木质素降解酶加入250mg/L的ABTS，菌丝周围形成黑绿色环，指示Lac和过氧化物酶存在加入0.1g/L的MnCl2·4H2O，平板上形成黑棕色斑点，指示MnP的合成平板测试系统agar-platetestsystem25g/L琼脂35mL接种直径10mm的琼脂菌丝块ABTS-平板Mn-平板腐殖酸-平板加入1g/L的煤腐殖酸，平板上发生漂白反应，指示木质素降解酶的系统的存在整理ppt白腐真菌木质素降解能力的平板鉴定这是一种快速评价白腐真菌木质素降解能力的平板方法。经典培养基PDA培养基去除土豆滤液基本琼脂培养基BAM培养基ABTS-琼脂培养基SYR-琼脂培养基Mn-琼脂培养基加入100mg/L的ABTS加入100mg/L的MnCl2·4H2O加入100mg/L的丁香连氮（吖嗪）加入10mL的各培养基，并植入5mm的琼脂菌丝块，每2～3日检测色变区和菌的放射性生长菌丝周围形成深绿色1周后在菌丝周围积累紫色醌类物2周后形成黑棕色的MnO2条纹整理ppt3、白腐真菌反应体系的建立白腐真菌反应体系的种类平板反应体系液体反应体系静置反应体系摇床反应体系主要用于酶和降解的定性研究主要用于酶学研究和降解反应的定性定量研究整理ppt建立白腐真菌反应体系需要考虑的基本因素（6大因素）培养基经典培养基的组成（L-1）0.2gKH2PO40.05gMgSO4·7H2O0.01gCaCl21mL无机溶液0.5mL维生素溶液1.2mmoL酒石酸铵（氮源）56mmoL葡萄糖（碳源）20mmoLDMS（缓冲成分）pH4.5维生素溶液（L-1）2mg生物素2mg叶酸5mg维生素B15mg烟酸5mg维生素B210mg维生素B6盐酸盐0.1mg维生素B125mgDL-泛酸钙5mg对氨基苯甲酸5mg硫辛酸无机溶液（L-1）1.5g氨基三乙酸酯3gMgSO4·7H2O0.5gMnSO41gNaCl2100mgFeSO4·7H2O100mgCoSO482mgCaCl2100mgZnSO4100mgCuSO4·5H2O10mgAlK(SO4)210mgH3BO310mgNaMoO4为防止培养基的微生物污染可以考虑在培养基分装前或是培养5天后加入20U/mL青霉素或是2mg/mL链霉素，不会影响木质素过氧化物酶的产生。整理ppt活性成分反应温度底物加入时间接种方式及接种量VA主要提高LiP的产量和活性；Mn(Ⅱ)主要提高MnP的产量和活性；Cu(Ⅱ)和小分子芳烃化合物主主要提高Lac的产量和活性；表面活性剂保护酶的活性，提高对降解底物的利用性；主要有两种反应温度，28℃以上39℃以下和25℃以上28℃以下；一般选择在接种以后的第6天，防止底物毒性抑制孢子的萌发，菌丝体的生长以及酶的合成及活性等；选择孢子悬浮液或是菌丝块，严格按照一定比例定量添加；整理ppt供氧供氧方式（主要针对液体反应体系）人工通气自然地复氧作用用通气装置或通气管，直接将空气或纯氧导入反应体系。一般间隔3天进行氧的补充。培养体系自身与环境进行气体的交换和氧气的补充。静置培养摇床培养采用浅层培养的方式。三角烧瓶装液量一般规律：10mL/125mL,20mL/250mL,50mL/500mL。摇床转速一般为100～200r/min。优点：加大了氧气的传输和传质效率；缺点：机械剪切力破坏酶结构与活性；解决途径：一是加入表面活性剂，二是将孢子、菌丝体或酶固定化；整理ppt4、白腐真菌的固定化（immobilizayion）技术白腐真菌固定化技术的类型共固定吸附法包埋法琼脂糖和琼脂小珠海藻酸钙小珠K-卡拉胶颗粒明胶包埋小块PVA包埋法多孔的聚合物聚氨酯泡沫小块多孔的聚氨酯颗粒植物纤维编织绳多孔陶瓷载体烧结玻璃载体整理ppt琼脂糖和琼脂小珠包埋法细胞或酶的包埋是生物固定化中最常用的方法。基本原理是将生物材料包裹和埋藏在水不溶性的凝胶聚合物的网络骨架中。用于包埋的凝胶聚合物，分为天然的高分子多糖类物质和合成的高分子化合物两大类。将白腐真菌的孢子包埋于琼脂糖胶和琼脂胶小珠内，制备方法如下：孢子悬浮液的制备要求孢子浓度达到107数量级每毫升配制2.5%（质量浓度）的琼脂糖或琼脂水溶液灭菌20分钟冷却至45℃1000mL琼脂糖或琼脂水溶液加入1mL混合已灭菌并冷却至45℃的葵花油45g加入混合浸入冰水冷却，继续混合30分钟无菌水洗涤至无油整理ppt海藻酸钙小珠方法一2g海藻酸钠溶解60mL蒸馏水海藻酸钠水溶液108℃，10分钟150mg干重的鲜菌团过滤、研磨40mL蒸馏水（无菌）菌的细胞悬浮液2%（质量浓度）海藻酸盐溶液2%（质量浓度）CaCl2溶液50mL滴入2h硬化海藻酸钙小珠多次洗涤整理ppt方法二2g琼脂和0.75g海藻酸钠溶解60mL蒸馏水海藻酸钠水溶液108℃，10分钟150mg干重的鲜菌团过滤、研磨40mL蒸馏水（无菌）菌的细胞悬浮液2%（质量浓度）海藻酸盐溶液2.5%（质量浓度）CaCl2溶液50mL10mL针筒，滴入海藻酸钙小珠多次洗涤形成小珠转入磷酸缓冲溶液1.460%K2HPO40.226%KH2PO4整理pptK-卡拉胶颗粒2gK-卡拉胶溶解60mL蒸馏水海藻酸钠水溶液108℃，10分钟150mg干重的鲜菌团过滤、研磨40mL蒸馏水（无菌）菌的细胞悬浮液2%（质量浓度）海藻酸盐溶液2%（质量浓度）KCl溶液50mL滴入2h硬化K-卡拉胶小珠多次洗涤K-卡拉胶颗粒常规制备方法条件优化与改进：以生理盐水为溶剂，卡拉胶浓度为3%（质量浓度），常规菌量的1/2，在2%（质量浓度）的KCl溶液中交联2h，切成小块。整理ppt明胶包埋小块含6.25g干重细胞的细胞悬浮液25mL10mL的20%（质量浓度）明胶10mL的1.875%（质量浓度）海藻酸钠40℃混合冷却至5℃软胶硬胶浸入40g/LCaCl2切割2mm明胶小块0.05mol/L磷酸钾缓冲液（pH7.6）洗涤，使海藻酸钙-明胶复合物中海藻酸盐漏出，直至洗涤干净海藻酸钙-明胶复合物使用0.01mol/L的戊二醛（0.05mol/L磷酸钾缓冲液）对多孔团块进行交联1h（pH7.6）无菌蒸馏水洗涤整理pptPVA包埋法PVA，聚乙烯醇，相对分子质量77000～79000，为人工合成的高分子化合物。PVA包埋最常用的是PVA-硼酸法浓缩的孢子（菌体）悬浮液含13%PVA和0.02%海藻酸钠（质量浓度）水溶液，60℃冷却至35℃混合，滴入含有2%CaCl2的饱和硼酸中在溶液中硬化24小时无菌蒸馏水洗涤直径3mm的PVA固定化小珠（约10%PVA，约10%活菌体细胞或孢子）整理ppt白腐真菌包埋技术初探环本053姚晶晶整理ppt－研究背景－白腐真菌处理有机固体废物时存在问题，即降解效率低，产生机械剪切力白腐真菌包埋技术能解决问题，防止机械剪切力的产生整理ppt－目的－

通过对白腐真菌菌剂的复活率、保存效果和制备成本的比较来选择制备白腐真菌菌剂的优势载体。为白腐真菌处理有机固体废物时减少杂菌感染率,寻求一种最佳的白腐真菌包埋手段。整理ppt实验用微生物菌种香菇（Lentinusedodes）：购自浙江省庆元县食用菌科研中心黄孢原毛平革菌（Phanerochaetechrysosporium）：

购自中科院微生物菌种保藏中心凤尾菇（Pleurotus

pulmononanus）：购自浙江省庆元县食用菌科研中心平菇（Pleurotus

ostreatus）：购自浙江省庆元县食用菌科研中心整理ppt纯培养的白腐真菌菌丝体整理ppt整理ppt－结果及分析－白腐真菌菌剂的感观四种白腐真菌菌剂的外观形态PVA包埋小珠色泽透明、弹性度强是最优选菌剂，K—卡拉胶包埋小珠湿度较大处于劣势地位。整理ppt白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况

黄孢原毛平革菌

用PVA对黄孢原毛平革菌进行包埋在本次实验中复活率最快，生长更浓密。整理ppt白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况

香菇

香菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋法和PVA小珠包埋法。整理ppt白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况

凤尾菇

凤尾菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋法和PVA小珠包埋法。整理ppt白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况

平菇

平菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋方法、PVA小珠包埋法、明胶小珠包埋法和K—卡拉胶小珠包埋法。整理pptK—卡拉胶

PVA

明胶钠酸藻海整理ppt白腐真菌菌剂的保存效果

感观变化（30天）K—卡拉胶包埋小珠的湿度变大，保存效果较差整理ppt白腐真菌菌剂的保存效果

复活率—黄孢原毛平革菌

四种包埋小珠的复活率不随着保存时间的延长而下降。菌丝体生长长度（cm）培养时间（d）整理ppt白腐真菌菌剂的保存效果

复活率—香菇

四种包埋小珠的复活率不随着保存时间的延长而下降。菌丝体生长长度

（cm）

培养时间（d）整理ppt白腐真菌菌剂的保存效果

复活率—凤尾菇

四种包埋小珠的复活率不随着保存时间的延长而下降。菌丝体生长长度（cm）

培养时间（d）整理ppt白腐真菌菌剂的保存效果

复活率—平菇

K—卡拉胶包埋小珠的复活率随着保存时间的延长而下降。菌丝体生长长度（cm）培养时间（d）整理ppt规格海藻酸钠（元）聚乙烯醇（元）明胶（元）K-卡拉胶（元）材料（1g）本次实验材料0.160.320.080.360.1280.380.40.8四种材料的制备成本比较制备成本分析本实验包埋150mg干重的白腐真菌所需的海藻酸钠和K-卡拉胶各需2g，明胶3g，聚乙烯醇（PVA）3.8g，此外PVA包埋时为防止粘交，要加入0.38g海藻酸钠。海藻酸钠小珠包埋法是最便宜实惠的包埋方法，PVA包埋法次之，K-卡拉胶包埋法是这四种包埋法中花费最多。

整理ppt

本研究结果证明：最适合白腐真菌包埋的方法是海藻酸钠小珠包埋法和PVA小珠包埋法。

综合结果表明：在白腐真菌处理有机固体废物时，海藻酸钠小珠包埋法是最适合选择。－总结－整理ppt吸附法利用微生物和载体（support）之间的吸附能力，将微生物结合在载体表面，形成微生物-载体复合物，这种固定方法称为吸附法（adsorption）；常见载体包括：尼龙网、聚氨酯泡沫、硅管、烧结玻璃、多孔陶瓷、聚丙烯等，其中尼龙网、聚氨酯泡沫、硅管、烧结玻璃较为常用；聚氨酯泡沫小块1cm3的聚氨酯泡沫小块，用无菌蒸馏水洗涤3次加入600mL蒸馏水加45块聚氨酯泡沫，灭菌无菌条件下过滤后，加入600mL培养基接种孢子悬浮液进行培养最终要求孢子悬浮液浓度达到2.5×105个/mL整理ppt植物纤维编织绳选用的植物编织绳可以是棉绳、麻绳、草绳，长短粗细可以根据实际需要进行调整选择，其中一般选择草绳可以获得较好的实际应用效果。制备过程：选择好的材料在质量浓度为1%的葡萄糖水溶液100mL中浸泡2h，在补充10mL质量浓度为1%的葡萄糖水溶液后灭菌。然后再混合体系中接入菌丝体，合适温度下培养1～2周，保证材料中均长满菌丝体。烧结玻璃载体利用玻璃粉在有空前体物存在的情况下进行烧结加工，制备多孔玻璃载体