课件基因工程的基本操作程序

第二节基因工程的原理和技术问题：如何使大肠杆菌生产出人的胰岛素？11获得人的胰岛素基因——目的基因的获取①将目的基因转移入大肠杆菌（1）将人的胰岛素基因拼接到大肠杆菌的质粒中

——形成重组DNA分子②（2）将重组质粒导入到大肠杆菌中？

——将重组DNA分子导入受体细胞③（3）人的胰岛素基因导入成功了吗？

——筛选含有目的基因的受体细胞④大肠杆菌能合成人的胰岛素

——目的基因的表达⑤2获取重组导入检测表达34一、目的基因的获取（获得人的胰岛素基因）DNA的粗提取51、从基因文库中获取目的基因：

(通常在未知DNA序列的情况下)基因组文库的构建：6cDNA文库的建立：7基因文库：

基因组文库：包含该生物的所有基因。cDNA文库：包含该生物的部分基因。

一般针对基因的编码区而建立。82、体外直接合成目的基因

(通常在已知DNA序列的情况下)①利用PCR技术扩增目的基因9变性退火延伸1011APCR全称为_________________。

C条件：____________________、__________、_______________________、____________。B原理：__________D结果：_____________________________________________________聚合酶链式反应DNA复制已知序列的目的基因四种脱氧核苷酸三磷酸一对引物DNA聚合酶使目的基因短时间内呈指数方式扩增E过程：________________________________________________高温变性、低温退火、中温延伸12由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列②利用DNA合成仪化学合成13

合成较小的基因（不超过几十个碱基）例：核酸分子杂交的探针，PCR扩增的引物等。DNA合成仪②利用DNA合成仪化学合成14运载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组运载体运载体自连目的基因自连AATTCG目的基因AATTCGGCTTAAGCTTAAGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG二、形成重组DNA分子（将人的胰岛素基因拼接到大肠杆菌的质粒中）15重组DNA分子一定能使目的基因表达吗？16重组DNA分子的组成：目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点参与的工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶二、形成重组DNA分子17三、将重组DNA导入受体细胞

（将重组质粒导入到大肠杆菌中）导入微生物细胞：用Ca2+处理受体细胞，将重组DNA与之混合；导入植物细胞：土壤农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法等导入动物细胞：对受精卵进行显微注射、胚胎干细胞技术、精子载体法等18土壤农杆菌法花粉管通道法基因枪法19例：用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物细胞，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过培养形成愈伤组织，最后发育成转基因植物。20目的基因导入动物细胞如：显微注射法动物细胞受精卵显微注射法21例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA。同样方法可获得疫苗、生长激素等。22四、筛选含有目的基因的受体细胞

（人的胰岛素基因导入成功了吗）DNA分子杂交技术：23抗药性筛选法：24互补显色筛选法：原核25营养缺陷性筛选法：载体分子携带营养成分（氨基酸，核苷酸）的生物合成基因，受体细胞基因突变，不能合成营养物质。两者构成营养缺陷。在缺少营养物质的培养基上受体细胞不存活，存活的是导入成功的受体细胞。26五、目的基因的表达（大肠杆菌能合成人的胰岛素吗）1、分子水平检测：检测转基因生物的DNA是否插入目的基因（即检测导入是否成功）检测目的基因是否转录出了mRNA：——分子杂交技术检测目的基因是否翻译成蛋白质：——提取蛋白质、抗原-抗体杂交272、个体水平检测：检测性状28总结：如何使大肠杆菌生产出人的胰岛素？29以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆

将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：

1．获得目的基因（和质粒载体）；

2．形成重