基因克隆操作过程教学课件

基因克隆操作过程概述1DNA的体外重组—酶切◎◎和连接(切、接)载体外源重组DNA分子DNA转化或转染2重组DNA分子的转化和扩细菌增(转、增)重组DNA增殖甲囊3转化子的筛选和鉴定(检)体培养∵::筛选含重组质粒的细菌2011-10-23基因克隆操restrictionendonucleaseDNAligase切接转增校88目88、DNA的体外重组(切与接)011-10-23基因克隆操作过程1DNA的体外重组(一)—切工具:限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)作用对象:目的基因片段、载体·目的:获得具有互补粘性末端(或平末端)的线性目的基因片段和线性化载体88睡882011-10-23HindⅢECOR■识别位点GAATTCCTTAAG■制品内容8-20U(商度二附带缓冲液Pvu‖lCAGCTG反应停止液10xLoadingButterGTCGAC反应温烹■制品内容[浓巴8~20U(高浓度30~60U附级冲液反应碳中2011-10-23基因克隆操作过各种限制酶酶切反应所使用的buffer(Takara)双酶联合酶切所使用的buffer(TakaraEnzymeAccIBamHIBgllClaIEcoRIEcoRVHin1xM05×K1×T1xM1×M|05×K1×MBamH10.5xK1×K1xK1xK1xK1xK0.5×KBgll1xT1×K1×H1×H1×H1xH2×KEcoRI1×M1×K1×H1×H1×H1×H1×M2011-10-23基ECORV0.5×K(1×KH1×H1xH2×THinc1×M05×K2×K1×M1xM2×T1×M单酶切实例(Takara)4.oryzaerIB40-amdS基因PCR扩增产物的ho单酶切分析1.Oryzaerib40-amds序列的限制性内切酶酶谱分析限制性内切酶所需bue特征序列。酶切位点l10×HCTCGAG.1655bp2.酶切样品:2007-6-4Horaerib40-amdSPCR产物的凝胶回收纯化样品3.OryzaeRIB40-andS基因PCR-oI单酶切体系(10y)组分所需体系山)备注ddH,>24forgerib40-and基因PCR纯化样品6010xHbuffer1.0(8U/)A7oI06用量不超过体系体积的10%4.酶切条件:各组分混匀后,封口膜封口,37℃保淵过夜进行醇切(水浴为佳)5.酶切时间:2007-6-418:002007-6-510:002011-10-23基因克隆操作过程双酶联合酶切实例(Takara)pPMA19质粒因的酶切分析1酶切方案设计(1)pMA质粒上的Bamo位点分析(如图)①BmH:2个②oI:1个(2)酶切结果分析pPMA质粒经BM+o双酶切应得到三个片段:200p、990bp、4032bp。2酶切体系及条件(1)酶切体系(20p)pPMA-BamHI+A7o双酶切组分体积(山)。备注IdhopPMA质粒。8.010×Buffer15Uu)BmH(30℃)不超过体系体积的10%8Ujul)al(37℃)(2)酶切反应条件:各组分混匀后,封口膜封口,34℃保温过夜进行酶切(水浴为佳)011-10-23基因克隆操作过程2.DNA的体外重组(二)—接工具:DNA连接酶(DNAligase)作用对象:具有互补粘性末端(或平末端)的线性目的基因片段和线性化载体目的:获得含有目的基因的环状载体88睡882011-10-23(1)单酶切产生的粘性末端的连接GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGEcoRI5AATTCG5AATTCCTTAA5′GCTTAA5退火GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGa)获得连接方GAATTCGAATTC向不同的两种CTTAACTTAAG产物;T4-DNAligase