细胞凋亡和疾病培训培训课件

细胞凋亡和疾病培训●

概述●

凋亡时细胞的主要变化●

细胞凋亡过程与调控●细胞凋亡的发生机制●

细胞凋亡常用的研究方法●

细胞凋亡与疾病2细胞凋亡和疾病培训一.概述(一)凋亡概念的提出

1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集从其周围的组织中脱落并被吞噬，机体无炎症反应。1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念。3细胞凋亡和疾病培训

apoptosis(细胞凋亡)：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡，又称programmedcelldeath,PCD(程序性细胞死亡)4细胞凋亡和疾病培训(二)细胞凋亡的研究历史

1.1972-1987：细胞凋亡的形态学及生物化学研究阶段：

1）利用光镜和电镜对形态学特征进行了详细的研究。

2）染色体DNA的降解。3）RNA/蛋白质大分子的合成。

4）钙离子变化。

5）内源性核酸内切酶。5细胞凋亡和疾病培训2.细胞凋亡的分子生物学研究阶段:

1）细胞凋亡的相关基因及调控

2）细胞凋亡的信号转导

3）细胞凋亡的各种分子及其相互作用

3.细胞凋亡的临床应用基础研究阶段

6细胞凋亡和疾病培训(三)细胞凋亡生物学意义确保正常发育、生长。维持内环境稳定。发挥积极的防御功能。7细胞凋亡和疾病培训二.凋亡时细胞的主要变化(一)形态学改变

8细胞凋亡和疾病培训正常细胞凋亡小体吞噬细胞坏死凋亡细胞凋亡与细胞坏死的比较9细胞凋亡和疾病培训细胞间连接丧失；2）胞体固缩；3）细胞器完整；4）核固缩；5）染色质边集；6）凋亡小体形成1、凋亡的主要形态学变化10细胞凋亡和疾病培训

表面的微绒毛消失，并逐步脱离与周围细胞的接触。细胞体积逐渐缩小，出现固缩(condensation)。胞浆脱水，胞膜迅速发生空泡化(blebbing)。内质网扩张并与胞膜融合，形成出芽(buding)现象。晚期出现染色质边集(margination)。线粒体和溶酶体的形态结构变化不大。

形成凋亡小体(apoptosisbody),这是凋亡细胞特征的形态学改变。*******11细胞凋亡和疾病培训2、细胞凋亡与坏死的比较

坏死凋亡

诱导因素强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生生化性质病理性，非特异性生理性或病理性，特异性特点被动过程，无新蛋白主动过程，有新蛋白合成，合成,不耗能，耗能形态变化细胞结构全面溶解、胞膜及细胞器相对完整，细破坏、细胞肿胀胞皱缩，核固缩

DNA电泳弥散性降解，电泳呈DNA片段化(180-200bp)，电均一DNA片状泳呈“梯”状条带炎症反应溶酶体破裂，局部炎溶酶体相对完整，局部无炎症症反应反应

凋亡小体无有

基因调控无有

12细胞凋亡和疾病培训3、

细胞凋亡、PCD的区别

特征PCD细胞凋亡

形态学细胞固缩，裂成小体同左膜完整性保持到晚期同左线粒体常有阵发的自噬作用无变化染色质凝聚，电子致密度加大着边自噬作用常有，但并非一定发生无潜伏期几小时几分钟到几小时蛋白质合成放线菌素D及放线菌酮放线菌素D及放线阻断死亡有时阻断死亡胞浆生化变化溶酶体酶活性有时增加，溶酶体增加，c-myc,偶有热休克蛋白、c-myc，c-fos?c-fos↑

核DNA电泳无梯状DNA梯状DNA图谱首先的表现蛋白质合成下降，方式改变内源性核酸酶活化13细胞凋亡和疾病培训4、细胞凋亡与胀亡的比较

胀亡凋亡早期细胞肿胀波及胞内结构细胞皱缩、体积缩小、胞浆浓缩胞浆疏松化并且有空泡形及出芽改变成体积增大形态变化胞膜完整性破坏、胞膜及细胞器相对完整

细胞器崩解

DNA电泳非特异性DNA片段化(180-200bp)，电DNA片段泳呈“梯”状条带炎症反应周围明显炎溶酶体相对完整，局部无炎症症反应反应

凋亡小体无有1997年美国毒理病理学会细胞死亡命名委员会将细胞死亡途径分为凋亡和胀亡（Oncosis）14细胞凋亡和疾病培训(二)细胞凋亡的生化改变1.DNA的片段化：判断凋亡发生的客观指标之一内源性核酸内切酶作用引起的DNA断裂产生的单链缺口优先发生于核小体连接区，使DNA断裂成核小体倍数大小的片段,即180-200bp倍数大小的片段,在琼脂糖凝胶电泳上出现典型的阶梯状DNA区带。

15细胞凋亡和疾病培训凋亡早期即发生；核小体间连接部位断裂成180～200bp整倍数片段；染色质DNA单链断裂。16细胞凋亡和疾病培训17细胞凋亡和疾病培训2.内源性核酸内切酶激活及其作用(Ca2+/Mg2+)DNaseⅠ、DNaseⅡ(pH=6.2左右）,TopoⅠ、TopoⅡ（解旋）

18细胞凋亡和疾病培训（1）caspases的结构

结构:caspase成员都具有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性，正常时它们都以酶原（30-50KD）形式存在，包括三个结构域：一个N末端原结构域，一个大亚基（20Kd），一个小亚基（10kd）。3.caspases激活19细胞凋亡和疾病培训（2）caspases特点：⊙活性中心半胱氨酸⊙在催化底物时，总是在天冬氨酸残基的C端裂解底物⊙caspases酶原的活性很低，需要切除氨基端的一段序列才能被激活⊙活化的caspases能够特异水解一套蛋白底物,从而导致细胞凋亡

⊙细胞内caspases与其抑制剂总是共存，以免Caspases酶原被意外激活，对正常细胞造成损伤20细胞凋亡和疾病培训（3）caspases分类：根据大小亚单位序列的同源性以及功能:细胞因子处理组：1，4，5，11，12，13，14凋亡起始组：2，8，9，10凋亡效应组：3，6，7，21细胞凋亡和疾病培训(4)caspase的活化:前体的N-端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N-端前肽，然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，由大亚基和小亚基组成异源二聚体，再由两个二聚体形成有活性的四聚体。22细胞凋亡和疾病培训（5）激活方式：⊙自活化（autoactivation）:长原结构域(caspases-8,10)⊙转活化（transactivation）:短原结构域(caspases-3,6,7)⊙连接调节亚单位激活:(caspases-9)⊙非caspase蛋白酶的活化（activationbynon-caspaseproteinases）:细胞毒性T淋巴细胞的颗粒酶B(caspase-3,7,8,910）

，组织蛋白酶G(caspase-7）

23细胞凋亡和疾病培训Apaf-124细胞凋亡和疾病培训（5）激活方式：⊙自活化（autoactivation）:长原结构域(caspases-8,10)⊙转活化（transactivation）:短原结构域(caspases-3,6,7)⊙连接调节亚单位激活:(caspases-9)⊙非caspase蛋白酶的活化（activationbynon-caspaseproteinases）:细胞毒性T淋巴细胞的颗粒酶B(caspase-3,7,8,910）

，组织蛋白酶G(caspase-7）

25细胞凋亡和疾病培训（6）目前已知的Caspase功能有：①灭活凋亡抑制蛋白。②直接作用于细胞结构，裂解核纤层，使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。

③分解与细胞骨架构成相关的蛋白其中包括凝胶原蛋白（gelsin）、聚合粘附激酶（focaladhesionkinase,FAK）、P21活化激酶α（PAKα）等，引起细胞结构重组、凋亡。④caspase可使一些与DNA修复、复制和mRNA缝结有关的蛋白的调节区和催化区解离，瓦解核结构，使细胞降解为凋亡小体。26细胞凋亡和疾病培训(7)Caspase的抑制剂：①病毒性抑制剂：1)牛痘病毒蛋白CrmA（cytokineresponsemodifierA）：直接作用于成熟Caspase活性位点有效抑制Caspase1，4，6，8，对Caspase2，3，7，10效果差2)P35:以竞争性结合的方式与靶分子形成稳定的具有空间位阻效应的复合体27细胞凋亡和疾病培训②肽类抑制剂：Ac-DEVD.CHO,AcYVAD.CHO,z-VAD.fmk③Bcl-2蛋白家族：④其他:NO及其相关分子，锌3)杆状病毒蛋白IAP（inhibitorofapoptosisfamilyprotein，7种），不是活性位点特异性抑制剂4)V-FLIP：包含两个DED，与Caspase竞争结合死亡受体复合物5)蛋白HBx（乙肝病毒编码）：Caspase-328细胞凋亡和疾病培训

4、大分子合成

(1)细胞凋亡需要RNA和（或）蛋白质的合成，大分子合成抑制剂可阻断细胞凋亡；(2)细胞凋亡发生前所需生物大分子已存在于细胞内，只是被分割开来或以无活性状态存在，其活化需要磷酸化、去磷酸化或某些离子的存在,除非有活化信号传入，它们对细胞并不造成损害，这种情况下细胞凋亡不受蛋白质或RNA合成抑制剂的影响；

29细胞凋亡和疾病培训(3)细胞内已有凋亡所需的大分子物质，只是其功能被其它生物大分子（如bcl-2）的连续合成所抑制，此时蛋白质或RNA合成抑制剂能促进细胞凋亡的发生。5、钙离子的动员30细胞凋亡和疾病培训内钙释放外钙内流

[Ca2+]i增加

内钙释放和外钙内流途径钙池31细胞凋亡和疾病培训Ca2+↑引起细胞凋亡的机制线粒体肌浆网损伤刺激肌浆Ca2+↑钙蛋白酶染色质凝集磷脂酶磷脂分解谷氨酰胺转移酶骨架蛋白破坏核酶染色体损伤32细胞凋亡和疾病培训似秋叶的凋零，告别生命之辉煌；那难以计数的攻击、诱导，轻启着道道程序，逼细胞步步走向生命的末端；啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡;33细胞凋亡和疾病培训危难中的细胞啊，你沉稳不乱，DNA片片切割，化云梯直通天堂；细胞体分团相聚，把生命的凝重浓集在小体上；分别了朝夕相处的伙伴，再见了快乐美好的时光；这一切的一切又融入临近的胞体，腾出的空间再写生命的篇章。

34细胞凋亡和疾病培训三.细胞凋亡过程与调控35细胞凋亡和疾病培训凋亡诱导因素受体cAMPCa2+神经酰胺凋亡信号转导+DNase激活Caspases激活细胞凋亡的执行死亡信号凋亡相关基因激活凋亡基因激活巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞凋亡细胞的清除(一)细胞凋亡过程36细胞凋亡和疾病培训凋亡过程受体cAMPCa2+神经酰胺凋亡相关基因激活信号转导细胞膜细胞核凋亡诱导因素+Dnase激活Caspases激活死亡信号37细胞凋亡和疾病培训apoptosis凋亡过程与调控凋亡过程执行凋亡凋亡细胞的清除Dnase激活Caspases激活38细胞凋亡和疾病培训(二)细胞凋亡的调控1.细胞凋亡的诱导与抑制

39细胞凋亡和疾病培训40细胞凋亡和疾病培训2.细胞凋亡信号的转导(transduction)

◎多样性◎偶联性◎同一性

◎多途性

41细胞凋亡和疾病培训死亡受体是一组TNF受体基因超家族的成员，包括Fas(CD95,Apo1)，TNFR1(P55,CD120a)，死亡受体DR3、DR4、DR5等。其结构特点为胞外区有一半胱氨酸富集结构域(cystein-richdomain)，胞内区有一死亡结构域(deathdomain,DD)。它们是一组膜蛋白，与FADD结合，而FADD的聚集则通过其死亡效应区(deatheffectdomain,DED)激活caspase-8。(1)

死亡受体途径

42细胞凋亡和疾病培训

Fas配体(凋亡信号)

Fas(DR)细胞膜

Fas(deathdomain)FADD(Fas-associateddeathdomain)Caspase-843细胞凋亡和疾病培训44细胞凋亡和疾病培训45细胞凋亡和疾病培训46细胞凋亡和疾病培训(2)线立体途径:47细胞凋亡和疾病培训SMase鞘磷脂神经酰胺(ceramide)磷酸胆碱(phosphocholine)TNFα、糖皮质激素、电离辐射、紫外线(3)以神经酰胺为第二信使介导的细胞凋亡

48细胞凋亡和疾病培训(4)DAG/PKC系统49细胞凋亡和疾病培训(5)cAMP/PKA信号系统

PKA使关键的蛋白质分子发生不同程度的磷酸化，进而影响内源性核酸内切酶的活性，在研究糖皮质激素诱导胸腺细胞凋亡时，即发现cAMP和内源性核酸内切酶与细胞凋亡呈正相关的现象。

50细胞凋亡和疾病培训(6)胞内Ca2+信号系统51细胞凋亡和疾病培训3.凋亡相关基因(1)bcl-2及其相关基因：B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcelllymphoma/leukemia-2），1984年从滤泡性淋巴瘤发现，存在于核膜和线粒体。1988年首次证实bcl-2基因的高表达可引发肿瘤，bcl-2家族至少有15个成员。1)抑制凋亡bcl-2亚族：bcl-2、Mcl-1、bcl-w等,存在于线粒体膜上。抗凋亡的主要机制是：

52细胞凋亡和疾病培训

◎直接的抗氧化◎抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质◎抑制促凋亡调节蛋白Bax、Bak的细胞毒作用◎抑制凋亡蛋白酶(caspases)的激活◎维持细胞钙稳定53细胞凋亡和疾病培训

2)促进凋亡bax亚族：bax、bak、bad、bik、bid等，存在于线粒体膜上和内质网膜上。Bax与bcl-2相关蛋白很高的同源性，编码三个蛋白：Bax-α、Bax-β和Bax-γ。bcl-2与Bax的比率不同也可影响细胞凋亡。3)Bcl-X：

Bcl-XL(241氨基酸):与bcl-2同源性74%Bcl-Xs(178,少63)

54细胞凋亡和疾病培训BCL-2家族成员55细胞凋亡和疾病培训P53基因WtP53

修复受损的DNA，如修复失败则诱导细胞凋亡突变的P53失活的P53丧失监视DNA损伤的功能射线，毒素P53蛋白+细胞凋亡分子警察促进凋亡基因(Mtp53）56细胞凋亡和疾病培训双向调控基因

C-myc是一种癌基因，是调控细胞周期的主要基因。编码的蛋白是DNA结合蛋白，调控基因转录，在GF充足时主要激活介导细胞增殖的基因；反之激活凋亡基因。

C-myc57细胞凋亡和疾病培训促进凋亡基因抑制凋亡基因

双向调控基因FasBaxICEp53c-mycBcl-x

EIB、IAP、Bcl-2

凋亡相关基因58细胞凋亡和疾病培训正常细胞

调控细胞凋亡的某些基因间的相互关系ICE、Wtp53

细胞凋亡

ICE促进

Bax、C-myc、fas抑制

BcL-2Mtp53

凋亡

Wtp53

BCL-2Bax㈠㈠

㈠

㈩㈩

诱导和抑制细胞凋亡基因59细胞凋亡和疾病培训60细胞凋亡和疾病培训61细胞凋亡和疾病培训四.细胞凋亡的发生机制(一)氧化损伤在细胞凋亡中的作用(二)钙稳态失衡(calciumdyshomeostasis)(三)线粒体损伤在细胞凋亡中的作用

62细胞凋亡和疾病培训(一)氧化应激引起细胞凋亡的可能机制是：●氧自由基引起的DNA损伤可激活p53基因。

●氧自由基引起的DNA损伤可活化聚ADP核糖转移酶，引起NAD快速耗竭，ATP大量消耗。

●氧自由基攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化直接造成细胞膜的损伤可诱导细胞凋亡。63细胞凋亡和疾病培训

●

氧化应激可激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，也可产生膜的发泡现象。

●

氧化应激引起细胞膜结构的破坏，可改变细胞膜的通透性使Ca2+内流增加，诱导细胞凋亡。

自由基对线粒体膜损害导致其通透性和膜电位的变化诱导细胞凋亡。

●氧化应激可活化核转录因子NF-kB和AP-1，可加速细胞凋亡相关的一些基因的表达，诱发细胞凋亡。●64细胞凋亡和疾病培训(二)钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制：

●激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链；●激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰基转移，在肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成；

●激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录；

●Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露出核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于DNA内切酶切割DNA。

65细胞凋亡和疾病培训

Bcl-2

(－)(－)

线粒体PTP开放

Apaf+Cyt.C

Caspase-9酶原Caspaes-9

△ψm下降

Caspase-3酶原Caspase-3Caspase抑制剂

AIF蛋白质水解

无活性核酸内切酶

细胞凋亡

核酸内切酶激活

DNA断裂Ca2+NO缺血缺氧活性氧（+）(－)（+）（+）（+）(－)（三）线粒体损伤在细胞凋亡中的作用66细胞凋亡和疾病培训2002年10月7日英国人悉尼·布雷诺尔；美国人罗伯特·霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。2002年诺贝尔生理与医学奖获得者（图片来自http://www.nobel.se/）67细胞凋亡和疾病培训细胞凋亡检测方法基于形态学观察的染色法基于DNA片断化的检测法膜联蛋白检测法Caspase酶分析法流式细胞仪定量分析法五.细胞凋亡常用的研究方法68细胞凋亡和疾病培训（一）细胞凋亡的形态学研究方法1、光学显微镜和倒置显微镜

（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

69细胞凋亡和疾病培训2、

荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

常用的DNA特异性染料有：HO33342(Hoechst33342)，HO33258(Hoechst33258),DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

3、透射电子显微镜观察

结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

70细胞凋亡和疾病培训71细胞凋亡和疾病培训72细胞凋亡和疾病培训73细胞凋亡和疾病培训74细胞凋亡和疾病培训凋亡细胞超微结构改变（扫描电镜）75细胞凋亡和疾病培训凋亡细胞超微结构改变（透射电镜）核浓缩呈球形染色质边聚呈新月形76细胞凋亡和疾病培训坏死细胞凋亡细胞77细胞凋亡和疾病培训

鉴定细胞凋亡的形态学常用方法特性

推荐使用手段说明细胞表面改变

胞浆改变

染色质凝聚核裂解

超微结构

扫描电镜

相差显微镜

相差显微镜荧光显微镜

流式细胞仪

透射电镜

微绒毛消失，芽状突起。见到凋亡小体细胞皱缩，质膜变形，胞浆空泡适用于组织切片用结合DNA的染料(PI)标记。适用于培养细胞定量测定DNA含量，测量细胞的大小和蛋白。用于培养细胞完整的细胞器，胞浆空泡，核染色质凝聚核裂解，凋亡小体，适用于组织切片或培养细胞78细胞凋亡和疾病培训（二）DNA降解分析1、DNAladder:进行DNA的凝胶电泳和溴化乙啶染色（琼脂糖凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、DNA印迹、脉冲场电泳、单细胞电泳技术等）79细胞凋亡和疾病培训细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0h2．细胞色素c诱导1h3．细胞色素c诱导2h4．细胞色素c诱导3h5．细胞色素c诱导4h6．阴性对照7．Marker

80细胞凋亡和疾病培训82细胞凋亡和疾病培训83细胞凋亡和疾病培训（三）酶学分析研究方法1、Caspase3活性测定（1）Westernblot分析Procaspase-3的活化Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。

84细胞凋亡和疾病培训（2）Caspase-3作用的特异底物(荧光测定免疫吸附法,FIENT)乙酰化天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酰胺,(Ac-DEVD),设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。而且Caspase3活性的大