分子生物学课件MBchapter-7-protein-synthesis

第七章蛋白质的生物合成－翻译Chapter7proteinbiosynthesis（translation）2023/7/232本章主要内容参与蛋白质生物合成的主要物质蛋白质生物合成的过程翻译后的加工蛋白质生物合成干扰和抑制2023/7/233以氨基酸为原料以mRNA为模板以tRNA为运载工具以核糖体为合成场所起始、延长、终止各阶段蛋白因子参与合成后加工成为有活性蛋白质一.参与蛋白质生物合成的主要物质2023/7/2341、mRNA与遗传密码（geneticcodon）mRNA上存在遗传密码

遗传密码:DNA（或mRNA）中的核苷酸序列与蛋白质中氨基酸序列之间的对应关系称为遗传密码。密码子(codon)：mRNA上每3个相邻的核苷酸编码蛋白质多肽链中的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子或三联体密码（tripletcodon）2023/7/2351954，Gamov

提出三联体密码子a.遗传密码的证实1961年Crick等证实了三联密码的真实性Nirenberg以均聚物及核糖体结合实验破译遗传密码

Khorana特定共聚物遗传密码1966，64种密码子全部测完2023/7/236缺失或插入核苷酸引起三联体密码的改变CATCATCATCATCATCATCATCACATCATCATCATCCATCACAXTCATCATCAT

CAXTXCATX

CATCATCAT-1-1,+1+32023/7/237无细胞系统的建立:1961年Nirenberg建立了无细胞系统1955S.Ocha在细菌中分离了多核苷酸磷酸化酶（polynucleotidephosphorylase）,它催化核糖核苷二磷酸的聚合，它不需要任何DNA模板就可合成.2023/7/238他们的方法是:(1)去模板：用DNAase处理E.coli抽提物，使DNA降解，除去原有的细菌模板。

(2)加入polU：合成了多聚苯丙氨酸这一结果不仅证实了无细胞系统的成功，同时还表明UUU是苯丙氨酸的密码子。分别加入polyA，polyC和polyG结果相应地获得了多聚赖氨酸，多聚脯氨酸和多聚甘氨酸。2023/7/239(3)按比例加入２种核苷混合的多聚物如：在底物中加5份的UDP和1份的GDP，碱基比为U：G＝5：1，它们能组成8种三联体：

UUU，UUG，UGU，GUU，

GGG，GGU，GUG，UGG。2023/7/2310如UUU：UGG＝（555）:（511）＝25：1同理UUU：UUG＝5：1，根据检测结果推测:苯丙氨酸（UUU）：半胱氨酸（UGU）＝5：1苯丙氨酸（UUU）：缬氨酸（GUU）＝5：1苯丙氨酸（UUU）：甘氨酸（GGU）＝25：12023/7/2311核糖体结合实验1964年Nirenberg又采用核糖体结合实验(1)tRNA和氨基酸及三联体的结合是特异的；(2)上述结合的复合体大分子是不能通过硝酸纤维滤膜的微孔，而tRNA-氨基酸的复合体是可以通过的。2023/7/23122023/7/2313以特定的共聚物为模板指导多肽的合成Khorana采用了有机合成一条短的单链DNA重复序列然后用DNApol合成其互补链，再用RNApol及不同的底物合成两条重复的RNA共聚物，作为翻译的mRNA，加入到体外表达系统中根据合称的肽链（以同位素标记）的相应序列来推测各氨基酸的密码子2023/7/23142023/7/23152023/7/2316Ser丝氨酸;Thr苏氨酸;Tyr酪氨酸;Phe苯丙氨酸；Leu,亮氨酸2023/7/23171954，Gamov

提出三联体密码子a.遗传密码的证实1961年Crick等证实了三联密码的真实性Nirenberg以均聚物及核糖体结合实验破译遗传密码

Khorana特定共聚物遗传密码1966，64种密码子全部测完2023/7/2318起始密码(initiationcodon):

AUG

终止密码(terminationcodon):

UAA，UAG，UGA

共６４个，其中６１个为有意义密码（20种氨基酸？）开放读码框：从mRNA5’端起始密码子AUG到3’端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放读码框（openreadingframe,ORF）。2023/7/2319遗传密码表2023/7/2320b、遗传密码的基本特征（1）连续性编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。如插入或缺失一碱基，可造成移码突变。Thr苏氨酸;Leu亮氨酸2023/7/2321（2）密码子的简并性同一个氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称密码子的简并性（degeneracy）。对应于同一种氨基酸的不同密码子称同义密码子（synonymouscodon）大多数简并性表现在密码子的第三个核苷酸上，即第一、二个核苷酸确定后，第三个核苷酸可变。2023/7/2322氨基酸密码子的简并性

简并密码子越多，生物遗传的稳定性越大，氨基酸出现频率越高意义：色氨酸甲硫氨酸2023/7/2323（3）摆动性（wobble）AUC123摆动配对转运氨基酸的tRNA的反密码需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码反向配对结合，但反密码与密码间不严格遵守常见的碱基配对规律，称为摆动配对。

三中读二（2outof3reading）2023/7/2324密码子、反密码子配对的摆动现象tRNA反密码子第1位碱基IUGACmRNA密码子第3位碱基U,C,AA,GU,CUG2023/7/2325三中读二一般可分为三种情况：(1)第１,２两个碱基形成６个氢键时，可三中读二。如CCX，CGＸ，GCX和GGX。(2)第1,2两个碱基形成4个氢键时,不可三中读二。如AAX，AUX，UAX和UUX。(3)第1,２两个碱基形成５个氢键时,

当第二个碱基为嘧啶时，可三中读二；如UCX，ACX，CUX和GUX。当第二个碱基为嘌呤时则不能三中读二，如CAX，GAX，UGX和AGX。2023/7/2326

密码子的使用频率与tRNA的数量有关（4）密码子的偏爱性（codonusagebias）如：亮氨酸Leu有6种不同密码子，但CUG使用很高，而CUA使用率就很低。

同一物种中，编码同一氨基酸的密码子的使用频率不同。

不同物种间（原核和真核生物），编码同一氨基酸的密码子的使用频率也不同。需要量多的蛋白质有关codonusage高相应tRNA量多2023/7/2327CodonusageObservedforE.coliRibosomeProteincodons2023/7/2328CodonusageinthegenesofAnimalscodons2023/7/2329（5）通用性和变异性蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。动物细胞的线粒体DNA（mtDNA）、支原体及少数纤毛类原生动物的编码方式与通用密码子有所不同。2023/7/2330CodonUsualmeaningAlternativeOrganelleororganismAGAAGGArgStop,SerSomeanimalmitochondriaAUAIleMetMitochondriaCGGArgTrpPlantmitochondriaCUNLeuThrYeastmitochondriaAUUGUGUUGIleValLeuStartSomeprotozoansUAAUAGStopGluSomeprotozoansUGAStopTrpMitochondria,mycoplasma线粒体密码子的特殊性2023/7/2331---aaacceptarm;loadingaaat3’end---DHUloop;

contactwithAARS---anti-codonloop;

34thiswobblebase---TΨCloop;

contactwith5srRNA---extraloop;

342、tRNA2023/7/2332tRNA的三级结构示意图(倒L形)2023/7/2333种类起始tRNA---tRNAimet只能识别翻译起始信号AUG只能结合于核糖体的肽位普通tRNA----tRNAmet在翻译延长中发挥作用只能结合于核糖体的氨基酰位起始tRNA与普通tRNA2023/7/2334原核生物起始tRNA延长tRNA真核生物起始tRNA延长tRNA起始密码只能辨认甲酰甲硫氨酸（fMet)，

fMet-tRNAimet延长识别Met时为Met-tRNAmet起始密码只能辨认甲硫氨（Met)Met-tRNAimet延长识别Met时为Met-tRNAemet2023/7/23352023/7/2336

原核和真核生物核糖体的组成及功能核糖体亚基rRNAs蛋白

RNA的特异顺序和功能细菌

70S

50S23S=2904b31种(L1-L31）含CGAAC和GTψCG互补2.5×106D5S=120b66%RNA30S16S=1542b21种(S1-S21)16SRNA(CCUCCU)和S-D

顺序(AGGAGG)互补哺乳动物

80S

60S28S=4718b49种有GAUC和tRNAfMet的TψCG互补4.2×106D5S=120b60%RNA5.8S=160b

40S18S=1874b33种和Capm7G结合

3、核糖体的结构和功能2023/7/2337核糖体的组成2023/7/2338mRNA结合位点：与mRNA结合，位于30S亚基上P位：即肽位(peptidylsite)，或给位，肽酰tRNA占据的位置，肽链转位至此，延长继续。A位：即氨基酰位(aminoacylsite)，或称受位，每次延长，氨基酰tRNA就加入到A位上E位：排出位(exitsite)，空载的tRNA从此位点被排出

活性位点2023/7/23392023/7/2340原核生物翻译过程中核蛋白体结构模式:A位：氨基酰位(aminoacylsite)P位：肽酰位(peptidylsite)E位：排出位(exitsite)2023/7/2341蛋白质生物合成体系n氨基酸蛋白质mRNA、tRNA、rRNA酶、蛋白质因子、ATP、GTP2023/7/2342二、蛋白质的翻译过程

肽链合成的方向：氨基端（N端）羧基端(C端)

由多种蛋白因子和RNA分子参与包括氨酰－tRNA复合物的形成，翻译的起始，延伸和终止过程2023/7/2343（1）氨基酰-tRNA分子的形成氨基酸的活化氨基酸+ATP+tRNA氨基酰-tRNA合成酶氨基酰-tRNA+AMP+PPi1、氨酰－tRNA复合物的形成2023/7/2344（2）氨基酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetase，AARS)存在于胞液中，催化一个特定的aa结合到相应的tRNA分子上。

每种氨基酰tRNA合成酶对相应氨基酸以及携带氨基酸的数种tRNA具有高度特异性，保证tRNA能够携带正确的氨基酸对号入座。2023/7/2345（3）氨酰tRNA合成酶的鉴别功能动力学校对（Kineticproofreading）化学校对（Chemicalproofreading）2023/7/2346以aa为准校正tRNA2023/7/2347以tRNA为准校正aa2023/7/2348◆氨基酰-tRNA的表示方法：

Ala-tRNAAla

Ser-tRNASerMet-tRNAMet◆起始肽链合成的氨基酰-tRNA

真核生物：Met-tRNAiMet

原核生物：fMet-tRNAifMet2023/7/23492、翻译的起始肽链合成起始阶段，是指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核糖体结合而形成翻译起始复合物的过程。需要起始因子（IF或eIF）和ATP、GTP参与。

翻译的起始是mRNA能忠实翻译的关键步骤，也是调节蛋白质合成的部位。2023/7/23501.核糖体大、小亚基分离;2.mRNA在小亚基定位结合；

S-D序列：又称核糖体结合位点(ribosomalbindingsite,RBS)，是mRNA起始密码上游的一段富含嘌呤核苷酸的序列，该序列以…AGGA…为核心。

IF1、IF3协助3.起始氨基酰-tRNA（fMet-tRNAifMet

）在小亚基上就位；4.核糖体大亚基结合。（1）原核生物翻译的起始2023/7/2351小亚基与mRNA的结合S-D序列5’3’小亚基2023/7/235230S起动复合物的形成30S小亚基30S小亚基+IF1+IF3IF1+IF330S小亚基＋mRNA+IF1+IF3mRNA30S小亚基+mRNA+IF1+IF2+IF3+GTP+甲酰蛋氨酰tRNAIF2+GTPAUG5'3'IF-3IF-1IF-2GTP甲酰蛋氨酰tRNA30S启动复合体2023/7/2353三种起始因子IF1IF2

IF3功能辅助IF3结合30S小亚基，占据A位点特异识别fmet-tRNAifmet形成fmet-tRNAifmet-IF2-GTP有GTP酶活性结合30S小亚基使核糖体解离促进30S小亚基与mRNA结合2023/7/235430S启动复合体30S小亚基+mRNA+IF1+IF2+GTP+甲酰蛋氨酰tRNAIF330S小亚基+mRNA+50S大亚基+IF1+IF2+GTP+甲酰蛋氨酰tRNA50S大亚基30S小亚基+mRNA+50S大亚基+甲酰蛋氨酰tRNAGDP+PiGTPIF1+IF2IF-3IF-1AUG5'3'IF-2GTPGDPPi70S起动复合体的形成70S启动前复合体启动复合体2023/7/2355（2）真核生物蛋白质合成的起始2023/7/23562023/7/23572023/7/23582023/7/2359◆根据mRNA密码序列的指导次序从N端向C端添加氨基酸,延伸肽链,直到合成终止的过程◆每次循环增加一个氨基酸，包括以下三步：

进位(entrance)

转肽(peptidebondformation)

移位(translocation)◆延长因子(elongationfactor,EF)

EF-Tu:促进氨基酰-tRNA进入A位

EF-Ts:调节亚基

EFG:转位酶活性，促进卸载tRNA释放3、肽链的延长（elongation）原核生物：2023/7/2360根据mRNA下一组遗传密码指导，使相应氨基酰-tRNA进入核糖体A位。

TuTsGTPGDPAUG5'3'TuTsGDPTu-GTP进位(entrance)2023/7/2361延伸因子（elongationfactor）(1)当GTP存在时，EF-Tu呈活性状态。(2)当GTP水解成GDP时，EF-Tu便失活。(3)GDP被GTP取代后，它又恢复活性。2023/7/2362由转肽酶(transpeptidase)催化的肽键形成过程肽基转移酶转肽（transpeptidation）2023/7/2363转肽酶肽键位置转肽酶（大亚基）催化形成肽键P位：f-met-（肽酰）的α-COO-+A位：氨基酰的α-NH4+

形成肽键A位：反应在此位上进行（P位上的f-met退至A位）生成的二肽在A位上。P位空留：P位上无负载的tRNA在肽键形成前脱落。（出位，E位）2023/7/2364移位（Translocation)EF-G

有转位酶(translocase)活性,可结合并水解GTP，促进核糖体向mRNA的3'侧移动2023/7/2365移位

在A位的二肽链从A位进入P位酶位置方向转位酶----EF-G有GTP酶活性P位：肽-tRNAA位：空留下一个AA进入mRNA：从5’3’

移动1个带有肽链的tRNA：从A位P位肽链合成：从N端C端延长2023/7/2366fMetAUG5'3'fMetTuGTP2023/7/2367

真核生物翻译的延伸2023/7/23684、翻译的终止（termination）需要释放因子（RF）的参与。

原核生物RF：RF-1、RF-2、RF-3

真核生物RF：eRF

RF1：作用于UAA、UAGRF2：作用于UGA、UAARF3：促进释放结合GTP/GTP酶活性当出现mRNA的终止密码后，多肽链合成停止，肽链从肽酰－tRNA中释出，mRNA、核糖体大、小亚基等分离，这些过程称为肽链合成终止。2023/7/2369UAG5'3'RFCOO-2023/7/2370真核细胞蛋白质合成的特点核糖体为80S，由60S的大亚基和40S的小亚基组成起始tRNA为Met－tRNAiMet起始复合物结合在mRNA5’端AUG上游的帽子结构，真核mRNA无富含嘌呤的SD序列（除某些病毒mRNA外）由多种起始因子参与（eIF1,eIF2,eIF3等十多种

）真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落肽链延伸因子（EF1,EF2）及释放因子（eRF可识别3种终止子）2023/7/2371三、蛋白质的运输及翻译后修饰1974年，布洛贝尔发表了“信号假说”，推测蛋白质包含一内在的转运与定位信号，决定着其到达并跨越相应的细胞膜结构。

后来，布洛贝尔发表了蛋白质定位的普遍原理：每一蛋白质结构中都含有定位于细胞内特异位置所需的信息；特定的氨基酸序列决定着蛋白质是穿越细胞膜结构，还是成为膜的组成部分，或是被转运出细胞外。

2023/7/23722023/7/2373◆信号序列(signalsequence)

所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称为信号序列靶向输送蛋白信号序列或成分分泌蛋白信号肽内质网腔蛋白信号肽C端-Lys-Asp-Glu-Leu-COO-(KDEL序列)线粒体蛋白N端靶向序列（20～35氨基酸残基）核蛋白核定位序列（-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val）过氧化体蛋白-Ser-Lys-Leu-（PST序列）溶酶体蛋白Man-6-P（甘露糖-6-磷酸）靶向输送蛋白的信号序列或成分（1）信号肽引导蛋白质达到靶部位2023/7/2374多位于多肽链的N端10－40个氨基酸残基N端:带正电荷氨基酸残基中间:疏水的核心区C端:可被信号肽酶识别并裂解信号肽1—10aa15—20aa15—30aa1—3aa富含Arg+,Lys+-----富含Phe,Leu,Ile…亲水螺旋疏水螺旋S.S.酶切割位点2023/7/2375信号识别体（signalrecognitionparticle，SRP）由一分子RNA(长300nt)和6个不同的多肽分子组成

SRP有两个功能域：一个用以识别信号肽;另一个用以干扰进入的氨酰-RNA和肽酰移位酶的反应，以终止多肽链的延伸作用。

2023/7/2376信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网信号肽与SRP结合→肽链延伸终止→SRP与受体结合→SRP脱离信号肽→肽链在内质网上继续合成，同时信号肽引导新生肽链进入内质网腔→信号肽切除→肽链延伸至终止→翻译体系解散2023/7/23772023/7/23782023/7/2379（2）线粒体蛋白的靶向输送2023/7/2380信号序列定位转运装置信号序列位置位于N端，富含带正电荷的和疏水的氨基酸，形成两性α螺旋，转运后被切除。基质TOMTIM23不被切除，含疏水性的停止转移序列，被安插到外膜。外膜TOM被切除，含疏水性的停止转移序列，被安插到内膜。内膜TOMTIM23含两个信号序列，首先转运到基质，第一个信号序列被切除，第二个信号序列引导蛋白进入内膜或膜间隙。内膜膜间隙TOMTIM23结构类似于N端信号序列，但位于蛋白质内部。内膜TOMTIM23为线粒体代谢物的转运蛋白，如腺苷转位酶，具有多个内部信号序列和停止转移序列，形成多次跨膜蛋白。内膜TOMTIM22线粒体蛋白分选信号2023/7/2381（3）细胞核蛋白的靶向输送2023/7/2382

一级结构的加工修饰：1．N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除：N端甲酰蛋氨酸，必须在多肽链折叠成一定的空间结构之前被切除。①去甲酰化：

甲酰化酶甲酰蛋氨酸-肽甲酸+蛋氨酸-肽

②去蛋氨酰基：

蛋氨酸氨基肽酶

蛋氨酰-肽

蛋氨酸

+肽

六、蛋白质前体的共价修饰2023/7/2383氨基肽酶甲酰化酶2023/7/2384

2．氨基酸的修饰：由专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、羟基化、磷酸化、甲酰化等。

3．二硫键的形成：由专一性的氧化酶催化，将-SH氧化为-S-S-。

4．肽段的切除：

由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除。

2023/7/2385

高级结构的形成：1．构象的形成：在分子伴侣及辅助酶的协助下，形成特定的空间构象。2．亚基的聚合。3．辅基的连接。

2023/7/2386（一）抗生素（antibiotics)

由微生物产生的具有抑制其它生物生长的物质。

1.四环素（tetracyclin）族

2.氯霉素（chloromycetin）

3.链霉素(streptomycin)和卡那霉素(karamycin)

4.嘌呤霉素（puromycin）

5.放线菌酮（cycloheximide）

四、蛋白质生物合成干扰和抑制2023/7/2387四环素族氯霉素链霉素和卡那霉素

嘌呤霉素放线菌酮2023/7/2388抗生素作用点作用原理应用四环素族（金霉素新霉素、土霉素）链霉素、卡那霉素、新霉素氯霉素、林可霉素红霉素梭链孢酸

放线菌酮嘌呤霉素原核核糖体小亚基原核核糖体小亚基原核核糖大亚基原核核糖体大亚基原核核糖体大亚基真核核糖体大亚基真核、原核核糖体抑制氨基酰-tRNA与小亚基结合改变构象引起读码错误、抑制起始抑制转肽酶、阻断延长抑制转肽酶、妨碍转位与EFG-GTP结合，抑制肽链延长抑制转肽酶、阻断延长氨基酰-tRNA类似物，进位后引起未成熟肽链脱落抗菌药抗菌药抗菌药抗菌药抗菌药医学研究抗肿瘤药抗菌素类阻断剂2023/7/2389（二）毒素

白喉毒素对真核生物的延长因子EF-2起共价修饰作用，生成EF-2的腺苷二磷酸核糖衍生物，从而使EF-2失活。（三）干扰素（interferon,IF）

由真核生物细胞感染病毒后分泌的具有抗病毒作用的蛋白质。可以诱导一种蛋白激酶使eIF2发生磷酸化，从而抑制病毒蛋白质的生物合成；干扰素还可诱导生成一种罕见的寡核苷酸，可活化一种称为RNaseL的核酸内切酶，由RNaseL降解病毒RNA

。2023/7/2390

1994年Perler等首先提出

蛋白内含子又称为内蛋白子（intein）是一种翻译后加工的产物。蛋白外显子又称为外蛋白子（extein）.

内蛋白子的基因不是单独的开放阅读框（ORF），它是插入在外蛋白子的基因中，和内含子的区别在于它可以和外蛋白子的基因一道表达，而不是mRNA阶段被切除，它在产生前体蛋白以后再从前体中被切除掉，余下的外蛋白子连接在一起成为成熟的蛋白。

五、蛋白质剪接2023/7/2391Proteinsplicing(蛋白质剪接)istheautocatalyticprocessbywhichaninteinisremovedfromaproteinandtheexteinsoneithersidebecomeconnectedbyastandardpeptidebond.Extein(外蛋白子)sequencesremaininthematureproteinthatisproducedbyprocessingaprecursorviaproteinsplicing.Anintein

(内蛋白子)isthepartthatisremovedfromaproteinthatisprocessedbyproteinsplicing.2023/7/2392Figure26.24showsthatthegeneistranslatedintoaproteinprecursorthatcontainstheintein,andthentheinteinisexcisedfromtheprotein.About100examplesofproteinsplicingareknown,spreadthroughallclassesoforganisms.Thetypicalgenewhoseproductundergoesproteinsplicinghasasingleintein.2023/7/2393

内蛋白子的基因除了上下代的垂直传递以外，还可以通过基因的转变而进行水平传递，被称为内蛋白子归巢（inteinhoming）。归巢内切酶作用于内蛋白子基因的等位基因上，在不含内蛋白子的等位基因上剪切一个缺口，然后内蛋白子基因在重组酶、DNA聚合酶、连接酶、分解酶的作用下，利用同源重组，将内蛋白子基因的拷贝转移到不含内蛋白子的等位基因上。2023/7/2394发现的内蛋白子有7种，多分布于酵母和微生物中，内蛋白子的分子量为40－60kDa,有高度保守的末端氨基酸：N-端常为Cys或Ser,C-端总是His-Asn。内蛋白子未剪切前称为融合内蛋白子（fusedintein）,可催化前体的自我剪接反应；剪切后的内蛋白子称为游离内蛋白子（freeintein）,可以作为归巢内切酶（homingendonuclease）参与内蛋白子的归巢。它可识别DNA上内蛋白子基因在外蛋白子基因子的插入位点。2023/7/2395ProteinsplicinghasthesameeffectasRNAsplicing:asequencethatisrepresentedwithinthegenefailstoberepresentedintheprotein.ThepartsoftheproteinarenamedbyanalogywithRNAsplicing:exteinsarethesequencesthatarerepresentedinthematureprotein,andinteinsarethesequencesthatareremoved.ThemechanismofremovingtheinteiniscompletelydifferentfromRNAsplicing.2023/7/2396Thefirstreactionisanattackbyan-OHor-SHsidechainofthefirstaminoacidintheinteinonthepeptidebond