社区医院检验专业技能培训课件

革兰染色法(Gramstain)

(一)原理：几种学说

1、等电点学说：G+菌的等电点比G-菌的等电点低，在同一pH条件下，阳性菌比阴性菌所带电荷要多，与带正电荷的碱性染料结合力强，不易脱色。

2、化学学说：G+菌含有大量核糖核酸镁盐，与进入细胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95％乙醇脱色，而G-菌含此种物质少，故易被乙醇脱色。

3、细胞壁结构学说：G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚且具有三维空间结构，脂类含量低，乙醇不易透入，而且95％乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小，通透性降低，阻碍结晶紫和碘的复合物渗出，而G-菌的细胞壁较疏松，肽聚糖层薄且无三维空间结构，含脂质量高，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫和碘的复合物被溶出而脱色。目前认为细胞壁与化学组成上的差异是染色反应不同的主要原因。

(二)试剂：

l、结晶紫溶液

2、革兰碘液

3、95％乙醇

4、稀释石炭酸复红

(三)操作步骤：

细菌标本涂片固定后，先用结晶紫(或龙胆紫)初染lmin；小水流冲洗后加碘液媒染1min；小水流冲洗后用95％乙醇脱色1min；小水流冲洗后稀释复红复染30sec，小水流冲洗后使涂片自然干燥，镜检。

(四)结果判定：

1、革兰阳性细菌：不被乙醇脱色仍保留紫色为革兰阳性菌(G+菌)，如葡萄球菌、链球菌等。

2、革兰阴性细菌：若被乙醇脱色后再被复染成红色者，为革兰阴性菌(G-菌)，如大肠埃希菌、伤寒沙门菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等。

(五)革兰染色的重要实际意义：1、鉴别细菌：可将所有细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌两大类，有助于进一步鉴别。

2、选择药物的参考，临床上可根据病原菌的革兰染色性，考虑选择有效的药物进行治疗。

3、与致病性有关：许多革兰阳性菌能产生外毒素，而革兰阴性菌则大多能产生内毒素，两者致病作用不同。

细菌的接种方法

(一)器材：

l、接种针和接种环:它们由镍铬合金或白金丝制成。接种环的直径约2--4mm，一个合格的接种环是正圆形，连接端没有空隙；接种针长50—80mm。两者上端连接有一绝缘柄的金属棒，全长为145mm。

2、固体培养基

3、酒精灯

(二)接种方法：

主要应用平板划线法。另外还有琼脂斜面接种法、穿刺接种法、液体培养基接种法、倾注平板接种法和涂布接种法。平板划线法分为分区划线法和连续划线法。

(三)平板划线法操作步骤：

1、接种环在火焰上灭菌。

2、用灭菌后的接种环取标本。

3、在固体培养基上划线接种。

(四)判断接种效果：要求接种后平板上划线轨迹连续、平滑，平行的划线之间不可重合，平板经孵育培养后，应沿划线出现单个菌落。室内质控操作步骤

(一)前期准备工作

室内质控分为最佳条件下的变异(OCV)和常规条件下的变异(RCV)两种情况，前者反映实验室最佳状况下的质控情况，而后者反映实验室日常情况下的质控情况。

l、最佳条件下的变异(OCV)

OCV表示本室在当前条件下该项目检测所能达到的最好精密度水平，是本室工作水平的一个基础指标。OCV测定采用与常规工作相同的检测方法、试剂和仪器，但应保证测定是在本室所能达到的最理想、最稳定的情况下进行。比如所用仪器等应新近经过校准，试剂新鲜配制，由操作熟练、富有经验的人员进行。在测定全过程中应尽量控制温度、光照、反应时间等一切可能影响测定结果的因素。选择瓶间差小、稳定性良好的质控品，每天做4、5批测定，每批一瓶质控品，在4、5天内即可得到至少20份数据，分别计算其、S、CV值，此CV值即为OCV。所测得的OCV综合表达了批间和日间精密度。

2、常规条件下的变异(RCV)RCV表示本室在当前条件下常规工作中该项目检测的精密度水平。RCV的测定方法与对应的OCV测定方法相似。不同点仅在于测定RCV时应使用与常规工作完全相同的条件，而不要有任何特殊对待。即应当把质控品完全当成病人标本，每天由该项目常规检测的操作者将它随病人标本同批检测，以便真实反映常规检测的精密度。在常规室内质量控制工作中，每更换一次质控品的批号，均应对新批号的质控品进行RCV测定。RCV是常规条件下的变异，是日间精密度的表达指标。因此，测定时质控品必须保证使用和标本相同的处理条件，而且每天要重新启用一瓶，并只测一次。20个数据要来自20天测定。一天内测多个数据，甚至一批内测多个数据，或每天将一瓶质控品分成若干份，测定后求均值作为当天的数据等做法均是错误的。这样得出的RCV往往比真实情况要小一些。RCV的计算方法与OCV完全相同。

3、室内质量控制工作的进行

完成了OCV和RCV的测定和计算后，根据计算出的靶值和允许误差范围等数据绘制质控图，然后正式开始常规工作中的室内质量控制，每天随常规标本对该批质控品进行测定，并将结果画在基于RCV测定得到的质控图上。特别要注意的是，根据RCV绘制的质控图对于同一批号质控品是不变的，它与每个月常规室内质量控制工作中所得到的数值无关。

(二)室内质控的实际操作

设定质控图的中心线(均值)

(1)暂定中心线(均值)的确定

在开始室内质控时，首先要建立质控图的中心线(均值)。均值必须在实验室内使用自己现行的测定方法进行确定。定值质控品只能作为确定中心线的参考，不能用质控品上标明的量作为均值。为了确定中心线，新批号的质控品应与当前使用的质控品一起进行测定。根据20或更多批获得的质控测定结果，对数据进行离群值检验(剔除超过3s外的数据)，计算平均值，作为暂定中心线(均值)。此暂定中心线作为下一个月室内质控图的中心线(均值)进行室内质控；一个月结束后，将该月的在控结果与前20个质控测定结果汇集在一起，计算累积平均值(第一个月)，以此累积的平均数作为下一个月质控图的中心线(均值)。重复上述操作过程，连续3—5个月。(2)常规中心线(均值)建立

以最初20个数据和3--5个月在控数据汇集的所有数据计算的累积平均数作为质控品在有效期内的常规中心线(均值)，并以此作为今后室内质控的中心线(平均值)。对个别在有效期内浓度水平不断变化的项目，则需不断调整中心线(均值)。

(二)设定控制限

对新批号质控品应确定控制限，控制限通常以标准差倍数表示。

1、稳定性较长的质控品

(1)暂定标准差的设定操作过程与设定中心线(均值)过程基本相同，只是计算公式不同。

(2)常规标准差的设定(同上)

以前的标准差是几个月数据的简单平均或者是累积的标准差。标准差等于平均数乘以变异系数。

2、控制限的确定

通常以标准差的倍数表示控制限。在日常测定中，连续测定同一批号的质控血清20天以上或一个月，求出均值和标准差，再确定质控上限(UCL)和质控下限(LCL)。

(三)室内质控的具体操作程序

以均值-标准差(X-SD)质控图为例：

1、目的：监测分析的精密度。

2、方法：每天将质控品随病人标本在相同的条件下(环境、仪器、试剂和操作者)进行测定，并将测定结果描绘在事先做好的质控图上。三分类血细胞分析仪(COULTERSTKS血细胞分析仪)(一)工作原理

运用电阻抗原理测量细胞大小和对细胞进行计数，用比色法来测定血红蛋白，通过VCS技术对白细胞系统进行分类计数。

(二)操作方法

分两种模式：手工操作模式和自动进样模式。

1、手工操作模式：检查各种试剂存量→启电源→

STARTUP冲洗仪器→检查仪器空白背景是否正常*→仪器准备就绪→用质控品操作检查各参数是否在控**→输入样本条型码号→将样本插入吸样针内→按START→分析开始，结束→准备就绪→分析后检查试剂→按SHUTDOWN运行关机程序→关闭电源。

2、自动进样模式：检查各种试剂存量→开启电源→

按STARTUP冲洗仪器→检查仪器空白背景是否正常*→仪器准备就绪→用质控品操作检查各参数是否在控**→设置样本号和条形码号→将样本放入试管架内→将试管架放入进样池中→按START→分析开始，结束→准备就绪→分析后检查试剂→按SHUTDOWN运行关机程序→关闭电源。说明：

*一般要求WBC≤0．2*109／L，RBC：<005*1012／L，Hb<01．Og/L，PLT<10*109／L，未达要求清洗后重测。

**按照均值+SD法进行评价。

(三)保养与维护

l、每日保养

(1)开机后检查仪器电压是否正常。

(2)仪器温度要保持在20摄氏度以上；中午休息前做DRAINF12，让残留在小孔后少量废血排除，然后做PRIMEAPERTURE，重新冲洗管道即可，一般中午可不关机。

(3)关机时必须先关SHUTDOWN，然后再关机。

(4)及时清洗吸样针及废液槽积血。

(5)及时清洁仪器表面灰尘。

2、每月保养。

(1)清洗分血片

(2)清洗计数孔

①准备饱和NaClO溶液，l：1稀释。

②在主机键盘上按DRAIN，然后拿注射器吸入NaClO溶液，分别注入红／白计数池各10ml，浸泡5-10分钟后，按F12，DRAIN，按APERTUREPRIME,然后做一个血样，再按STARTUP。

(3)清洗过滤网

(4)清洗管道

3、每季度保养

(1)打开分析仪前面的门检查仪器内管路和阀门周围是否有盐类结晶残迹。

(2)用蒸馏水清洗去掉盐类结晶然后仔细擦干，如有必要清洗系统的两个样杯。4、年度保养

年度维修保养只能由COULTER当地的COULTER代理商指定的维修工程师来进行,年度保养包括：

(1)检查HgB光电比色计灯的状况并清洗比色通道。

(2)检查真空压力。

(3)检查起点和重点液面的准确性。

(4)检查阀门的状况。

(5)检查管路系统的状况。

(6)清洗仪器内部积尘。

(7)检查所有电子部分。

(8)检查或更换一些关键部分管道。

(9)更换液体过滤器。(10)更换仪器稀释部分的接头。

(11)检查清洗稀释部分的旋转阀

(12)更换进样器的针头。

(四)室内质控

1、质控物选择

由各仪器公司提供，与仪器配套的全血质控品。

2、质控方法

按照常规质控方法进行或启用仪器内部的X—B质控流程。尿分析仪操作程序

(一)尿干化学试带结构和检测原理

试纸条采用了多层膜的结构，第一层尼龙膜起保护作用，防止大分子物质对反应的污染；第二层绒制层可破坏维生素C等干扰物质；第三层是固有试剂的吸水层(即反应层)，可使尿液均匀地浸入，与固定在本层物质上的化学物质发生反应，产生颜色反应，并能抑制尿液流到相邻反应区；最后一层选取尿液不浸润的塑料片作为支持物。(二)尿分析仪工作原理

仪器由机械系统、光学系统和电路系统三部分组成。机械部分主要功能是将待测的试纸条传送到位，再将检测后的试纸条排进废物盒。光学系统通常包括光源、单色处理和光电转换三部分。光线照射到反应区的表面产生反射光，反射光的强度与各个项目的反应颜色成正比。不同强度的反射光再经光电转换器转换为电信号进行处理。然后电路系统将转换后的电信号放大，经模/数转换后送到CPU处理，计算出最终检测结果，然后将结果输出到屏幕显示并送打印机打印出报告。其中CPU不仅负责检测数据的处理，还控制整个仪器机械，光学系统的运作，并通过软件实现多功能操作。反射率计算公式:

R(%)=(Tm*Cs/Ts*Cm)*100%Tm：

试剂块对测定波长的反射强度

Ts：

试剂块对参考波长的反射强度

Cm：

标准块对测定波长的反射强度

Cs：

标准块对参考波长的反射强度尿液分析仪测试原理的本质是光的吸收和反射。试剂块颜色的深浅对光的吸收、反射不一样。颜色越深，吸收光量值越大，反射光量值越小，反射率越小;反之，颜色越浅，吸收光量值越小，反射光量值越大，反射率也就越大。换句话说，特定试剂块颜色的深浅与尿液样本中特定的化学成分浓度成正比。

(三)操作程序

1、打开电源开机进入测试界面。2、将室内质控品均匀滴在测试条上，放在仪器标本架上，进行检测，符合要求(不超过±2+的范围)，可开始病人标本的检测：否则寻找原因。3、将尿液均匀滴加在测试条上，并沾去多余尿液。

4、将测试条放入仪器，仪器自动测试并打印报告。

5、如白细胞、红细胞、亚硝酸盐及蛋白阳性四项检查中有任何一项呈阳性结果，则需镜检。

6、将仪器结果及镜检结果报告一起发送。

7、关机。

(四)室内质控

1、质控物的选择

多数采用人工尿液加入标准物作为质控物。实践证明：对于尿糖、尿蛋白、血红蛋白和白细胞基本能满足要求；但对于尿胆红质、尿胆原就不甚满意。配制后不能久放等原因，所以有的学者采用浓缩尿质控物，能得到较好效果。

2、质控步骤

首先应将质控物放入室温，使其温度与室温一致，否则会因温度影响使部分结果偏低。每次必须使用“正常”和“异常”两种浓度的质控物进行试验：一天内最好使用同一份质控标本。

3、结果分析

如果质控物的“正常”结果变成“异常”结果或“异常”结果变成“正常”结果，均为失控。或者质控物某一模块的测定结果超过靶值正负1和等级，即±2以上(含±2)也为失控。生化分析仪操作程序

(一)以日立7960为例

1、开电源开机仪器进入开机程序(仪器自检、清洗探针等)。

2、进入主界面。

3、根据需要查看试剂量，运行加试剂程序加入测试试剂，加入后再次查看新试剂量。

4、新批号试剂需要定标，进入定标程序，选择项目、定标液测试位置进行定标。

5、每日质控，根据测试项目选择质控，可选高、中低值，进入质控操作程序，选择项目、质控品测试位置开始测试，测试后查看结果，是否在控制范围内(一般为标准值±2SD)，如不在控，需要分析失控原因重新测定，达到标准方可测定病人标本。

6、病人样本检测：将离心后的病人标本放入测试架，进入测试界面，输入标本编号、标本位置、测试项目，按测试键开始测试，同时在中文电脑中输入病人信息(编号、姓名、年龄、性别、科室等)，注意仪器与中文电脑的病人编号及信息相对应。

7、审核结果:对结果进行审核分析，如发现可疑结果需要重复测定，并标明结果为重复测定结果，审核无误后发送化验单

8、测试结束后取出试剂，清洗仪器，进入关机程序关机，程序结束后关闭电源。

(二)以日立7170生化分析仪为例：

1、特别注意在开机自检时、在定标、测定时，请不要进行以下操作：(1)打开或关闭标本盘2的盖：(2)添加1D1或2D1：(3)添加或移动试剂盘Rl或R2中的试剂。

2、开机及仪器状态的确认

(1)光度计的检查(每天一次)，选主菜单MAINT／UTILITY

(2)选Maintenance，选PhotometerCheck，选Select。

(3)选Start打印出检查结果。

(4)检查打印结果：与上次相比不应有较大的增加。

3、准备试剂

(1)选REAGENT查看各试剂是否足够;

(2)添加了试剂后，选Level(让仪器测试试剂剩余量)。

(3)打开仪器左前门：添加清洗反应杯用的清洗剂(1NNaOH)。

4、检查校准品和质控样品是否足够。

5、一般样品输入及确认

(1)逐个样品输入：选

WORKPLACE．选NormalTs。

1)在Sample#输入标本顺序号(1-10000)，规定周一：从1001开始，周二：从2001开始，……体检标本：9001开始。2)输入标本盘号：数字1—9任选。

3)输入标本的位置号：数字l-

100。

4)输入项目。

5)然后Enter键

6)重复(5)一(6)进行下一标本项目的输入。

(2)批量输入：第一个标本按上述(1)一(4)输入选RepeatTS在LastSample#输入要重复项目的最后样品号，按Enter键。

(3)输入样品的修改或确认：在Sample#输入标本顺序号，(显示已输入样品的项目)确认或修改后，按Enter或Next显示下一个样品。

6、标本的放置：1-100放一般样品；E101-E110放急测样品；可用7170的样品杯；或上层至少有5mm不含纤维蛋白的血清和标本高度不低于5mm的试管：也可用RA的样品杯，但要小心放置，不能放到底。

7、校正、质控及分析样品

(1)选主菜单的START，在StartSample#打入开始测定的样本号(1—10000)。

(2)如果要先进行校正：在CalibrationStartup处选Yes(要先设定项目等)。(3)如果要先对个别项目进行重新校正：在cafibrationReCalib处选Yes(要先设定项目等)。

(4)如果要先测质控标本：在ControlStartup处选Yes。

(5)如果要对超过设定范围的项目进行自动稀释重测：在Rerun(Normal)处选Auto，(接着可选实时或批量重测)，然后按右下角的Start。

8、在测定过程中需要停止：

(1)按s．stop则停止加样，等待已加样的样品检测结果。

(2)按stop则停止所有操作，已加样的标本检测无效。

9、在操作中进行急诊样品的测定

(1)在样品盘1的急查样品位置(。E101-E110)上放急查的样品。

(2)选WORKPLACE，选StatTS，在Position处输入放置样品的位置号(101—110)。

(3)选项目键(输入急测项目)，然后按Enter键。急测样品会自动优先测定并打印。

10、测定结果的确认

用于审核测定结果及反应过程(反应曲线)，整批传送测定结果。

测定结果的审核。

(1)选WORKPLACE，选DataReview。

(2)左边为样品编号及其它信息，右边为该样品的测定结果。

(3)可以选ReactionMonitor(反应曲线)，加以确认。

11、关机及保养

完成所有检测，解决操作中出现的问题，添加好必要的试剂，进行每日的保养，关闭电源。酶联免疫技术操作

(一)仪器、

1、吸头和微量移液器

2、洗板机

3、37℃孵育箱

4、酶标仪

(二)常规操作步骤：

1、操作步骤：

(1)标本编号、离心，1500r／min，15min。

(2)取出试剂盒，包括阴性和阳性对照品，检查试剂盒有无破损，是否在使用有效期内。

(3)在室温环境里平衡温度30min。

(4)打开试剂盒，取出酶标板，按照说明书规定的步骤进行操作。(5)根据操作要求将待测血清原液或用稀释液做适当稀释(一般1：10到1：100)，每孔加100l血清，依次加样。(6)将96孔板用盖盖好，放进37℃恒温箱，1h。

(7)取出酶标板放进自动洗板机，进行洗涤。或者手工洗涤。

(8)每孔加入最适浓度的HRO标记抗体100l。

(9)将96孔板用盖盖好，放进37℃恒温箱，1h。(10)取出酶标板放进自动洗扳机，进行洗涤。或者手工洗涤。(11)每孔加入底物溶液100l。(12)将96孔板用盖盖好，放进37℃恒温箱，15-30min。

(13)取出酶标板每孔加入2mol／LH2SO450l终止反应。

(14)用底物溶液(空白对照)校正酶标仪零点。

(15)于492nm处测各孔的光密度(吸光度OD值)。

(16)每批试验均应设阳性和阴性对照孔。

2、结果判断：目前无统一方法，常用的有：

(1)以P／N比值≥2．1，即以

待测血清吸