第9章-基因工程基本技术课件

第九章基因工程基本技术第一节核酸的分离第二节ＰＣＲ技术第三节分子杂交第四节电泳技术第一节核酸的分离保证DNA一级结构的完整性排除其它分子的污染

RNA、蛋白质、多糖等一、DNA的提取1、提取原则基因组DNA的提取

CTAB法

SDS法质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法2、DNA提取的方法3、基因组DNA提取主要方法

CTAB法适用于植物组织，真菌等

SDS法适用于动物组织，血液，细胞，细菌，酵母等CTAB法(植物DNA提取经典法)原理CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃

时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液SDS法原理SDS阴离子去垢剂

高温（55～65℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析高盐(KAc或NH4Ac)或降低温度（冰浴）

使蛋白质及多糖杂质沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提

乙醇沉淀水相中的DNA裂解液上层溶液抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液液氮研磨SDS法流程图植物材料材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存4、DNA提取基本步骤

基因组DNA新鲜材料，低温保存血液基因组DNA提取选择有核细胞细胞培养时间不能过长含病毒的液体材料提取前先富集

质粒DNA对数期的菌体培养时应加入筛选压力低拷贝或大质粒，应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤

基因组DNA材料过多影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠

质粒DNA菌体量适当，除净培养基变性的时间不要过长（5分钟）控制复性时间，避免基因组DNA的污染G＋菌、酵母细胞酶或机械处理材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）蛋白酶处理材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤多糖的去除：多糖水解酶在提取缓冲液中加1/2体积氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤多酚的去除：加入还原剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：70％的乙醇洗涤材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀晾干DNA，让乙醇充分挥发材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存若长期储存建议使用TE缓冲液溶解

pH值为8.0，可防止DNA发生酸解DNA提取基本步骤5、DNA含量测定、纯度及质量的评定

目前主要采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法进行检测。1）琼脂糖凝胶电泳

1.所提植物DNA应呈现出一条分子量较大的清晰条带。

2.如在溴酚兰处出现明亮的荧光区？

3.如在样品槽内有荧光出现？

AB1234567891011121314151617181920植物总DNA电泳检测A、B：λDNA（100ng、200ng）泳道1～20：植物样品2）、紫外分光光度法测定

核酸的光谱学特性核酸（DNA和RNA）中的芳香碱基在260nm处具有最大的光吸收，这可方便地与蛋白质280nm相区别。核酸在260nm处的光吸收可用于测定其浓度。当浓度为1mg/mL，光程为1cm时，核酸的光吸收分别是：双链DNA（dsDNA）A260(OD260)=20RNA和单链DNA（ssDNA）A260(OD260)=25DNA的纯度和含量通常采用紫外扫描分光光度计观察DNA的吸收曲线，并测定OD260、OD280和OD230nm的吸光值。1.纯度通过比较OD260/OD280及OD260/OD230的比值，分析DNA的纯度。

纯DNA：OD260/OD280应为1.8，OD260/OD230应大于2.0。

OD260/OD280低于1.8：有蛋白质或多酚类物质污染.OD260/OD280大于1.8：有RNA污染。

OD260/OD230

小于2.0：有残存的小分子及盐类杂质。2.浓度：

DNA样品浓度（μg/μl

）=OD260×稀释倍数×0.05按1OD260=50gDNA/ml，计算基因组DNA含量。二、RNA提取

107

个细胞10μg30mg动物组织，

30-100mg植物组织rRNA占80-85％mRNA占1-5%AAAAAA细胞中RNA的含量AAAAAAtRNAmRNArRNARNAase1、RNA提取相关知识mRNA的应用

RT-PCR,Northern杂交，cDNA文库构建

mRNA末端快速扩增(RACE)，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸反应，体外转录RNA标记，RNA酶保护试验，RNA微注射(RNAMicroinjection)

RNA的不稳定性内因：核糖残基的2’和3’位置带有羟基，易被水解外因：内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活提取RNA的注意事项经常更换新手套。皮肤和实验室用品上可能有RNase，会导致RNase污染塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡4-10小时，再灭菌玻璃器皿可在180℃烘烤4小时塑料制品和枪头避免交叉污染常用的RNA酶抑制剂焦碳酸二乙酯（DEPC）与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂

异硫氰酸胍目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使RNA酶失活。

RNasin

从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。可以和多种RNA酶结合，使其失活。氧钒核糖核苷复合物由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

SDS、尿素、硅藻土等。

RNAsafe

RNasinRNA酶抑制剂动植物材料研磨或匀浆细胞裂解基因组DNA水相有机相RNA氯仿纯化pH5.7离心加入裂解液2.RNA提取流程示意图等体积异丙醇沉淀70％乙醇洗涤沉淀晾干溶解RNA吸附柱去蛋白液漂洗洗脱水相RNA柱纯化法：纯度高，无有机溶剂RNA提取流程示意图材料准备裂解细胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱纯化

RNA溶解保存植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位培养细胞除尽培养液消化系统的组织选取杂质少的部位细菌和酵母需要破壁处理样品切成小块投入液氮或专门的RNA样品储存液中保存液氮研磨时不要使液氮挥发净RNA提取基本步骤材料准备裂解细胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱纯化RNA溶解保存SDS、异硫氰酸胍、酚(TRNzol)裂解细胞灭活RNase要与细胞组织充分接触裂解尽量充分RNA提取基本步骤材料准备裂解细胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱纯化RNA溶解保存氯仿抽提时充分混匀离心分离两相，保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和DNA分布到有机相和中间层，RNA留在水相中注意避免吸入中间层不慎吸入再次用有机溶剂抽提RNA提取基本步骤材料准备裂解细胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱纯化RNA溶解保存异丙醇低温沉淀RNA高盐低pH值，核酸与硅胶膜结合70％乙醇洗涤，晾干用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA－70℃分装保存或加入RNase抑制剂(RNAsafe)RNA提取基本步骤

目前主要采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对RNA的质量和浓度进行检测。1）琼脂糖凝胶电泳

通过观察RNA琼脂糖变性凝胶电泳条带可检测RNA是否被分解。在有溴化乙锭存在的情况下，在紫外灯下能清楚地观察到28SrRNA和18SrRNA的两条电泳条带。如果RNA没有被分解，28SrRNA的亮度应当是18SrRNA的2倍，且这两条带没有弥散现象。3、RNA含量测定、纯度及质量的评定RNA电泳检测2）紫外分光光度法测定

核酸的光谱学特性:核酸（DNA和RNA）中的芳香碱基在260nm处具有最大的光吸收，这可方便地与蛋白质280nm相区别。RNA的纯度和含量

测定RNA于OD260、OD280和OD230的吸光值。按1OD260=40gRNA/ml计算RNA的含量。纯RNA：OD260/OD280应为2.0OD260/OD230应大于2.0

OD260/OD230是检测RNA纯度的重要指标。第二节PCR技术及其应用§1PCR技术原理§2PCR技术应用PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明1971年，1971年，美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及且当时(1970年)Smith等发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘……PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）；基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制；最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错；耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪；1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖。KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>，1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段TaqDNA聚合酶（thermus

aquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020二、PCR的基本原理PCR基本原理类似于DNA的体内复制。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR的基本步聚

1、变性

(Denaturation)

：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。

2、退火(Annealing)

：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。

3、延伸

(Extension)：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在条件下，5’→3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。72℃94℃55℃PCR循环(30-40)变性退火延伸PCR反应程序PCR反应程序PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95℃)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意图①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG加热94℃引物酶②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’引物酶3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC引物3’5’5’3’PCRCycle-Step3-

At72℃

TaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGDNA聚合酶5’5’3’3’引物引物Endofthe1stPCRCycle–ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一个循环需2-4min，2-3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’5’3’3’TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon三、PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应条件：10X缓冲液10μL4种dNTP混合物各200μM引物各10-100pM模板DNA

0.1-2μgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+

1.5mMPCR仪PCR仪PCR仪PCR反应过程PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA95℃1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应过程PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

PCR反应的特点PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(10-6g)水平；能从100万个细胞中检出一个靶细胞；病毒检测的灵敏度可达3个RFU；细菌检测的最小检出率为3个细菌。高度的特异性

Taq酶造成的碱基误配机率大约是1/20000简便、快速一次性加好反应液，2-4h完成扩增；从第3循环开始，DNA双链片段以2n增加。扩增产物一般用电泳分析。对标本的纯度要求低，适用样品广泛血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA。1、PCR反应成分1）模板

单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。模板不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100l。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件。四、PCR反应体系模板引物TaqDNA聚合酶4种dNTP混合物Mg2+10×缓冲液2）引物（1）浓度0.1-0.5M

浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。引物是PCR特异性反应的关键；PCR产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度；人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换HPLC进行纯化。引物在反应中的浓度要一致。如果引物浓度较大,在PCR产物检测时,在溴酚兰前面可以看到1条引物带(由于前后引物等大小)。如果引物太少,使得非特异性扩增发生,从而出现杂带。不同试验对浓度的要求也不一样,而引物浓度大对特异性PCR的结果影响不大,但是会造成试剂的浪费;引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体，二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/

L较好。（2)PCR引物的设计一般原则

根椐待扩增的DNA片段，设计其特异的上、下游引物①引物长度一般以18-30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。②避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。③G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40-60%之间，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带；ATGC尽可能选择碱基随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶连续排列。④要避免两个引物间特别是3’末端碱基序列互补以及同一引物自身3`末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。⑤引物3’末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3`末端为G、C或T时引发效率较高。⑥引物5’末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。⑦引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。⑧引物量：每条引物的浓度0.1-1M或10-100pM，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会3）TaqDNA聚合酶（thermus

aquaticus)目前有两种Taq脱氧核糖核酸聚合酶供应：天然酶：从栖热水生杆菌中提纯；基因工程酶：大肠菌合成；一般0.5-2.5U/50l；酶量过少影响反应产量；浓度过高可引起会造成杂带、特异产物带不清晰等不好的结果，浓度过低则得不到所需的产物。最可靠的做法是先做浓度对照,再根据结果决定最佳条件。4）dNTP

(dATP、dCTP、dGTP、dTTP4）

dNTP浓度取决于扩增片段的长度;

四种dNTP浓度应相等;

PCR常用的浓度为50-200μM，不能低于10-15μM。浓度过高会抑制Taq

酶的活性，易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量;

dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0-7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解；在PCR反应中，dNTP应为50-200

M，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。在一般的PCR反应中，各种NTP浓度为200

M/L时，Mg2+浓度为1.5-2.0mM/L为宜Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高反应特异性降低，出现非特异扩增，就会出现红彤彤一片涂布。

Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。6）10×PCR缓冲液：

500mM

KCl，

100mMTris-HCl(pH8.4)，

150mMMgCl2

，

1mg/ml明胶。

PCR反应体系：

10×PCRbuffer10μl

dNTPmix各200μM

引物11μM

引物21μMDNA模板50ng-1μg

Taq

酶2U

加双蒸水至总体积为100μlPCR扩增程序:

94℃,300S

94℃,60S

55℃,60S

72℃,60S

72℃,7min30

循环PCR条件的优化

1、反应缓冲液：50mMKCl，10mMTris-HCl(pH8.3，室温)，1.5mMMgCl22、dNTPmix：常用终浓度为50-400μM3、TaqDNA聚合酶：2-4U/100μl4、引物5、模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。6、循环2、循环参数变性使双链DNA解链为单链

95oC20-40秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸

70-75oC，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加PCRanalysisoftransgenicplantsMP12345678910CK

MP1234567891011CK五、PCR中应注意的事项（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：除模板外的所有组分§2

PCR技术应用一、PCR技术的主要类型㈠反向PCR㈥锚定PCR㈡不对称PCR㈦原位PCR㈢RT-PCR㈧重组PCR㈣差异显示PCR㈨免疫PCR㈤实时定量PCR㈩多重PCR1)反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶2）不对称PCR

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。

方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究

高浓度引物低浓度引物3）RT-PCR:是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应,用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性,克隆mRNA的5’和3’末端序列,以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增基因mRNA蛋白质多肽链4）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR

称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物5）实时定量PCR技术原理实时定量PCR（也称TaqManPCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（PerkinElmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。实时定量PCR(real-timePCR):通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积数量，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量PCR。实时荧光定量PCR:实时定量PCR在检测过程中通过检测标记的荧光信号的累积来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，故称为实时荧光定量PCR。原理和方法

FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光发射基因FAM(荧光发射峰值在518nm处)，靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(荧光发射峰值在582nm处)，探针的3’端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针切断,淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，因此用该技术可对模板进行准确定量。

实时PCR技术原理由于荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性。探针设计一般应符合以下条件：①探针长度应在20-40个碱基左右，保证结合特异性。②GC碱基含量在40-60%，避免单核苷酸序列的重复。③避免与引物发生杂交或重叠。④探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。

特点

FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。二、PCR技术应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他……第三节分子杂交一、核酸分子杂交的概念概念：用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中待测核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。

特点：灵敏度高，特异性强应用范围：

基因克隆的筛选酶切图谱制作基因组中特定基因序列的定量和定性检测基因突变分析疾病的诊断、微生物病原体检测二、核酸分子杂交的基本原理

1、变性：2、复性在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程。复性的影响因素：

单链核酸的起始浓度

核酸链长度（分子量）核酸分子的复杂性

温度离子强度（盐浓度）3、杂交

来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交核酸分子杂交固相杂交液相杂交印迹杂交斑点杂交原位杂交菌落原位杂交细胞原位杂交印迹杂交：包含三种技术，凝胶电泳、印迹技术、分子杂交。

DNA或RNA（酶切）↓

电泳分离核酸片段↓转移至固相支持物（印迹技术）↓杂交↓洗去未杂交探针↓杂交信号检测斑点杂交：被检的核酸样品直接点在固相膜上，不经过酶切、电泳及原位印迹过程。特点：简单、方便、经济。斑点杂交菌落原位杂交：将菌落或噬菌斑转到固相膜上，原位裂解细胞后使核酸固定在膜上，然后与探针杂交，用来筛选目的基因的重组体。菌落原位杂交示意图细胞原位杂交：用探针与固定在载玻片上的细胞或组织切片中变性的DNA或RNA杂交，通过原位杂交可以确定外源基因在染色体上的整合位点及在组织中的表达部位。染色体原位杂交（ＧＩＳＨ）三、核酸探针

定义：核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带有特殊的标记物。

1、探针的种类

2、理想标记物的特点

3、常用的标记物

4、探针标记方法

1、探针的种类

1）寡核苷酸探针

2）基因组DNA探针

3）cDNA探针

4）RNA探针

5）单链DNA探针

第三节分子杂交2、理想标记物的特点Ａ：标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。Ｂ：检测灵敏度高、特异性强、本底低，重复性好并且操作简便。Ｃ：稳定、环境污染少、经济。第三节分子杂交3、常用的标记物

放射性同位素：

3H、32P、35S、125Ｉ等。非放射性同位素：生物素类、酶类、荧光素等。

第三节分子杂交4、探针标记方法－－切口平移法、引物延伸法、末端标记法切口平移法引

物

延

伸

法末端标记法5’端标记3’端标记四、核酸杂交技术

膜上印迹杂交：将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程

DNA或RNA↓

电泳分离核酸片段↓转移至固相支持物（印迹技术）↓杂交↓洗去未杂交探针↓杂交信号检测１、固相膜的种类与选择良好的固相膜应具备的条件：

具有较强的结合核酸分子的能力（>10μg/cm2）；与核酸分子结合后不影响其与探针分子的杂交反应；与核酸分子结合牢固；非特异性吸附少；具有良好的机械性，柔软性好、韧性强，便于操作。

常用的固相膜：

硝酸纤维膜、尼龙膜、PVDF膜等1）硝酸纤维膜：是目前使用最多的固相支持物，对单链DNA或RNA在高盐条件下具有较强的吸附作用。单链DNA或RNA依靠疏水作用吸附在膜上，其结合能力可使80-100μg/cm2。

优点杂交信号本底较低。

缺点①结合的DNA易洗脱而使杂交信号下降，所以硝酸纤维素膜不能重复使用。②对小分子量的DNA片段（<200bp）结合能力不强。③在高盐条件下与DNA结合，故不适用于电转移。④易破裂。2）尼龙膜：经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的氨基相互交联，结合十分牢固。对单链和双链DNA及RNA的结合能力达到350-500μg/cm2。对小分子量的核酸片段（10bp）也有较强的结合能力。优点吸附力强（共价结合）、机械性能好（不易破碎、可重复使用）。缺点杂交信号的本底高。第三节分子杂交杂交本底信号的降低变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。2、印迹方法－－虹吸印迹法、真空转移法、电转移法虹吸印迹法（毛细转移法）