血红蛋白提取可修改版课件

血红蛋白提取绵阳中学2条α-肽链2条β-肽链

亚铁血红素2.血红蛋白由________和__________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的__________基团

故，本课题可选用猪、牛等其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白!∴血红蛋白呈红色！一、基础知识(一)蛋白质提取与分离的依据---根据蛋白质各种特性的差异：1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少3.溶解度4.吸附性质5.对其他分子的亲和力凝胶色谱法

凝胶电泳法

(二)蛋白质提取与分离的方法:（1）原理：（2）材料：凝胶大分子通过多孔凝胶颗粒的____,路程__,移动__小分子穿过多孔凝胶颗粒的____,路程__,移动__1、凝胶色谱法(分配色谱法)间隙内部短长快慢根据相对分子质量的大小分离蛋白质凝胶：微小的多孔球体，内部有许多贯穿的通道。化学本质多为：多糖类化合物，如：葡聚糖或琼脂糖。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子

洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。凝胶色谱柱（层析柱）（3）凝胶色谱法分离过程

凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示:演示结束如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等－－洗脱液抵制外界酸和碱对溶液pH的影响，在一定范围内保持pH稳定。（4）缓冲溶液◆作用：◆配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成(2)电泳的原理：2、凝胶电泳法(1)电泳的概念注：带电粒子向着_________________的电极移动。与其所带电荷相反带电粒子在电场作用下发生迁移的过程利用待分离样品中各分子带电性质的差异，分子本身的大小和形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现各种分子的分离注：影响蛋白质分子运动速度的因素：

决定运动方向电场作用力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√思考：蛋白质为什么带有电荷？许多生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电电泳原理示意图-----教材P66∴该电泳蛋白质迁移速率仅取决于分子大小（3）常用电泳方法琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳◆测定蛋白质分子量常用：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳注：

SDS的作用:消除净电荷对迁移率的影响SDS能使蛋白质完全变性，解聚成单条肽链。形成“蛋白质－SDS复合物”，掩盖了蛋白质间的电荷差别。且分子质量越大，电泳迁移速率越慢！课堂反馈1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A弄清各种蛋白质的空间结构B弄清各种蛋白质的功能C弄清各种蛋白质的合成过程D获得高纯度的蛋白质2．凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。

A、分子的大小B、相对分子质量的大小

C、带电荷的多少D、溶解度3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。

A、相同B、相反C、随机BB4、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是（）A、相对分子质量较小的蛋白质行程较大B、相对分子质量较小的蛋白质行程较小C、行程与蛋白质的相对分子质量大小无关D、二者根本无法比较课题3血红蛋白的提取和分离第二课时四川省绵阳中学邓志华回忆复习------血液组成成分知识填空----血液组成成分：血液由______和_______两部分组成。1.血细胞中____细胞数量最多，红细胞中含量最多的有机化合物是_________________2.血红蛋白由__________和________________构成的，其中每条肽链中都含有一个能与O2或CO2结合的___________基团，因其含有________而呈红色。血浆血细胞红血红蛋白2条α-肽链2条β-肽链

血红素亚铁血红素

本课题可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的红细胞来分离血红蛋白选材:思考：为什么以哺乳动物的红细胞为材料？无细胞核，无细胞器等结构，血红蛋白含量丰富，便于提取。二.实验操作(1)红细胞的洗涤(2)血红蛋白的释放(3)分离血红蛋白溶液样品处理粗分离纯化纯度鉴定透析除去分子较小的杂质通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度（1）红细胞的洗涤血液100mL低速短时间离心红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min步骤1、样品处理阅读教材P67思考：洗涤的目的是什么？用什么水洗涤？洗涤干净的标志是什么？重复洗涤3次，直至上清液没有黄色？3g柠檬酸钠注意：红细胞洗涤采用低速短时间离心！∵速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果！◆洗涤的目的------除去血浆蛋白等◆用什么水洗涤？-----0.9%的生理盐水◆洗涤干净的标志-----上清液没有黄色答案：初次离心后的结果：步骤1“样品处理”---(2)血红蛋白的释放1.用什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？2.采取了什么措施加速释放过程？分析：①蒸馏水的作用是__________________________。②加入甲苯的作用是________________________。③充分搅拌的目的是________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞破裂阅读教材P67思考：参观-----磁力搅拌器步骤1“样品处理”---(3)分离血红蛋白溶液分离过程:红细胞混合液高速离心10min如何除去小分子脂类物质？？过滤滤纸脂类物质血红蛋白----过滤！收集滤液于分液漏斗得到下层红色液体！透析袋步骤2、粗分离（即透析）20mmol/L磷酸缓冲液1mL1mL思考回答：透析的原理及目的分别是什么？透析的原理----半透膜的半透性(教材P67)透析目的----除去分子量较小的杂质！实际操作的透析袋（粗分离）透析过程动画演示：演示结束步骤3、纯化----凝胶色谱操作教材P68图5－19（1）凝胶色谱柱的制作：（2）凝胶色谱柱的装填：（3）样品的加入和洗脱：

（1）凝胶色谱柱的制作：(见教材P67)①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好插入玻璃管的一端注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面。否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成整体如图：装配好的凝胶柱返回材料：交联葡聚糖凝胶(G-75)（2）凝胶色谱柱的装填：（见教材P68）步骤操作要求①②③④⑤50㎝操作压，磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡打开下端，一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴

凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱阅读教材P68回答：“G”表示？“75”表示？注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不能有气泡存在返回（3）样品加入与洗脱(见教材P68—P69)

加样前：调节缓冲液面与凝胶面平齐注意：正确的加样操作：1.不要触及并破坏凝胶面2.贴壁加样3.吸管管口沿管壁环绕移动注意：1、洗脱液面不能低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，搅乱洗脱次序，降低分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。

加样后：样品渗入凝胶床→洗脱→收集色谱柱制作成功的标准：红色区带均匀一致的移动

收集得到的纯化后的血红蛋白步骤4、血红蛋白纯度鉴定（见教材P69）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：---详情请观看血红蛋白提取和分离的视频操作提示：（注意事项）1.红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；须低速、短时离心。2.凝胶的预处理：短时间沸水浴，还能除去微生物和气泡3.色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动

观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教材图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？三、实验结果分析与评价2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？如何判断？

由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出。3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？三、实验结果分析与评价知识小结血红蛋白的提取和分离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定课堂巩固练习1、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异