第二十四章病毒与细胞相互作用

第二十四章病毒与细胞的相互作用第一节病毒的培养第二节病毒与细胞的相互作用第三节病毒的干扰现象第一节病毒的培养动物接种禽胚培养细胞培养1、动物接种动物接种是增殖病毒常采用的一种途

径，但动物的品质对所增殖病毒的生物学性状影响极大，从而直接间接地干扰了生物制品的质量和实验研究结果。所有自从细胞培养广泛使用后，实验动物已经很少使用。2、禽胚培养禽胚培养技术目前仍然广泛的用于病毒的分离、鉴定、抗原制备以及疫苗生产等方面。鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖。目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。鸡胚3、细胞培养细胞培养（cellculture）是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成

单个乃至2~4个细胞团悬液进行培养。细胞培养已成为培养病毒的主要方法。（2）细胞培养的优点1、每个细胞生理特性基本一致；每个细胞瓶基本一致；2、能显示病毒的生长特征；3、能排除特异性抗体或非特异性抑制因子的干扰；4、细胞培养可以执行严格的无菌操作；5、可以进行许多检验项目；6、病毒的克隆只能应用细胞培养的空斑技术来完成。克服个体差异；（3）细胞培养的类型根据培养细胞的染色体和繁殖特性，细胞可分为3类：①原代细胞（primarycell）②二倍体细胞株（diploid

cell

strain）③传代细胞系（established

cell

line）①原代细胞由新鲜动物组织经过剪碎、胰酶消化、分散，获得单个细胞，再生长于培养皿中制备的细胞。②二倍体细胞株自继代培养的二倍体细胞中选育出的具有特殊生物学性质和标记的细胞，其细胞染色体数仍然为二倍体。③传代细胞系又称非二倍体细胞系（non-diploidedline），能在体外无限传代的细胞系，染色体数目不正常，为异倍体。这种细胞传代及培养方便是其优点，因此使用广泛。从染色体数目及增殖特性都类似于恶性肿瘤细胞，且多数来源于癌细胞，例如：

Hela细胞系（人子宫颈癌细胞）、RAG细胞系（鼠肾腺癌细胞）等，有致癌性，多用于病毒的分离鉴定，一般不用于疫苗的制备。组织细胞上皮细胞上皮样细胞纤维原细胞（4）细胞培养方法随着生物技术的发展，细胞培养的方法也日益增多，目前在兽医生物制品上使用的有下列几种方法：静置培养（stationary

culture）转瓶培养（roller

culture）悬浮培养（suspension

culture）微载体培养（microcarrier

culture）静置培养将消化分散的细胞悬液分装于细胞培养瓶或培养板中，静置于恒温箱中培养，数天后细胞在低层贴壁长成单层，为最基本的细胞培养方法。旋转培养通过使细胞培养瓶不断缓慢旋转（5-10r/h），使正常贴壁生长的细胞可以在细胞瓶的四壁生长，此法可提高贴壁生长细胞的产量，适用于疫苗生产。悬浮培养通过搅拌使细胞处于悬浮状态，补充营养物质，校正pH值，维持细胞的生长，可大大提高细胞的产量，适用于不需要贴壁生长的细胞，如肿瘤细胞系。微载体（悬浮）培养是在悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技术，适用于悬浮培养及不能够悬浮培养的贴壁生长的二倍体细胞，可大大提高细胞产量，适用于规模化疫苗生产。第二节病毒与细胞的相互作用一、病毒与细胞相互作用的类型1、杀细胞和非杀细胞感染病毒感染细胞后按细胞是否死亡分为杀细胞和非杀细胞感染两大类。杀细胞感染：是指在病毒感染后可致宿主细胞死亡的感染，可产生感染性病毒颗粒。非杀细胞感染：是指在病毒感染后不致细胞死亡，细胞形态改变（转化）或不改变，产生或不产生感染性病毒颗粒。一、病毒与细胞相互作用的类型2、生产性和非生产性感染生产性感染（productiveinfection）：病毒感染宿主细胞以后，能够产生和释放子代病毒颗粒，称为生产性感染。非生产性感染（nonproductive

infection）：病毒感染宿主细胞以后，不能够产生和释放子代病毒颗粒，也称为顿挫感染（abortiveinfection）

。一、病毒与细胞相互作用的类型3、允许性和非允许性感染允许性感染（permissiveinfection）：宿主细胞被病毒感染后，可让病毒完成复制过程。非允许性细胞（nonpermissiveinfection）：宿主细胞被病毒感染后，阻断了病毒复制过程

的某个环节，不能产生子代病毒颗粒。病毒感染允许性和非允许性细胞均可产生细胞病变。4、持续性感染持续性感染（persistentinfection）：是指持续长时间的感染。最重要的非生产性的病毒与细胞的相互作用是持续性感染或隐性感染，广义的持续感染还包括潜伏感染。持续性感染既可以是生产性感染，也可以是非生产性感染。潜伏感染的细胞在某些情况下并不释放病毒颗粒，但在被激活后则可变为生产性的。隐性或持续性感染也可能表现为转化。一、病毒与细胞相互作用的类型病毒与细胞相互作用的类型杀细胞变化持续性感染(非杀细胞)非生产性感染产生子代病毒细胞病变效应（CPE）产生

子代病毒不产生子代病毒细胞转化细胞无病变，但可能丧失某些功能细胞形态改变可无限制生长生产性感染生产性感染细胞通常无影响不产生子代病毒产生子代病毒致肿瘤DNA病毒致肿瘤反录病毒二、病毒引起的杀细胞变化细胞病变（CytopathicEffect，CPE）：是指病毒感染细胞后导致的细胞损伤。病毒产生CPE的能力与其对动物的致病力正相关，因此常以半数细胞感染量（tissuecultureinfectiousdose50，TCID50）来判定病毒的毒力。半数细胞感染量（TCID50）：引起接种的细胞半数发生细胞病变的活病毒量。CPE的表现因病毒与细胞的种类而异，有多种形式，如细胞圆缩、肿大、形成合胞体或空泡等，可表现为细胞膜的变化或细胞骨架的变化。上皮细胞–腺病毒未感染感染早期感染后期上皮细胞–呼吸合胞体病毒未感染呼吸合胞体病毒感染slidesfrom

CDC纤维原细胞–疱疹病毒感染早期感染后期未感染slidesfrom

CDC纤维原细胞–脊髓灰质炎病毒（小RNA

virus）未感染slidesfrom

CDC感染早期感染后期病毒引起的杀细胞变化类型1、涉及细胞膜的CPE许多病毒能改变宿主细胞膜的通透性，以完成其复制。最突出的是，有囊膜的病毒出芽过程中能将其融合蛋

白直接插入宿主细胞膜，结果导致膜融合以及合胞体

形成。合胞体（syncytia）：是病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞的细胞膜融合，形成多核的巨细胞。融合形成的融合桥可允许病毒亚单位如核衣壳、核酸等通过，以逃逸宿主的防御系统。细胞膜融合由病毒融合蛋白或其他表面蛋白介导，例如流感病毒的血凝素、新城疫病毒的F蛋白等。病毒引起的杀细胞变化类型2、涉及细胞骨架的CPE细胞骨架由微丝、中介丝及微管组成，与细胞结构的完整性、物质运输及运动性等有关。有些病毒感染可致微丝解聚，有的则能破坏微

管，均可造成严重的细胞损伤，导致细胞崩解。病毒引起的杀细胞变化类型3、病毒引致的细胞凋亡与坏死病毒感染引致的细胞死亡可分为凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。凋亡：也称程序性死亡。病毒感染引起的细胞死亡更多是因病毒感染引起了细胞的生理性死亡，也就是细胞凋亡所致。细胞死亡，总是发生在病毒复制完成之后；细胞凋亡，是在病毒子代产出之前自行死亡，是宿主细胞的重要防御机制。凋亡和坏死的细胞有不同的形态变化，凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，内源性核酸内切酶被激活，将细胞DNA降解成180～200bp的片段，在琼脂糖凝胶电泳时可见称之为

“梯带”(lader)的特征性电泳条带；坏死的细胞没有内切酶激活所致的变化。ADE病毒感染抗体依赖的增强作用（antibody-dependent

enhancement

of

viralinfection，ADE）：在病毒感染过程中，宿主产生的抗体与病毒结合，非但未能阻断病毒吸附宿主细胞，反而增强了病毒对细胞的感染，提高了病毒的滴度。原因：亚种和水平的抗体不能完全阻断病毒与细胞结合的表位，此免疫复合物与细胞Fc受体结合，导致抗体结合的病毒被细胞胞饮，从而促进了病毒感染。三、空斑形成Dulbecco于1952年建立了空斑试验（PlaqueAssay），用于活病毒粒子的计数。细胞单层接种病毒后再覆盖一层含营养液的琼脂层。这样病毒自感染细胞释放后不能悬浮于液体中，只能感染邻近与之接触的细胞，以致感染区由原始病灶向四周扩大，形成类似细菌的菌落，成为空斑、噬斑或蚀斑（

Plaque）。PLAQUE

ASSAYPLAQUE

ASSAYPLAQUE

ASSAY一个空斑可能由一个以上的病毒颗粒感染

所致，因此可将获得的单个空斑制成悬液，高度稀释后再作空斑，最终可获得只含一

个病毒颗粒及其子代的空斑，即为斑点克

隆，可进行病毒纯化。利用空斑技术可对

病毒定量，定量单位称为空斑形成单位（plaque-forming

unit，PFU）。PLAQUE

ASSAY空斑形成单位四、包涵体包涵体：某些病毒感染细胞的胞浆内和/或胞核内产生单个或多个、圆形或不规则、嗜酸性或嗜碱性的特殊小体，称为包涵体（inclusion

body，inclusion）。包涵体的形态、染色特性和存在部位以及在哪

些宿主细胞形成，具有病毒种属（型）的特性，常作为病毒性疾病诊断的一个依据。包涵体的性质有的是病毒集团，由大量病毒颗粒晶格样排列而成，如腺病毒、呼肠病毒的包涵体；有的是病毒成分的蓄积，如狂犬病毒产生的Negri氏体，是堆积的核衣壳；有的则是病毒合成的场所，称病毒工厂（viralfactory），如痘病毒的病毒胞浆；还有一些是细胞退行性变化的产物，如疱疹病毒感染细胞的染色质浓缩形成一个清晰可辨的圈，称“猫头鹰眼”。狂犬病病毒嗜酸性包涵体嗜酸性核内包涵体嗜酸性胞浆包涵体巨细胞病毒嗜碱性包涵体疱疹病毒核内包涵体五、病毒引致的非杀细胞变化非杀细胞病毒的感染通常引致持续感染，对细胞的新陈代谢无大碍，还可产生并释放子代病毒颗粒，细胞大多能继续生长并分裂，多见于某些RNA病毒的感染，尤其是某些副黏病毒。除少数例外，大多数持续感染的细胞发生慢性渐进性变化直至死亡。一般持续感染往往并不影响宿主器官的功能，而对哪些不能迅速替补修复的细胞如神经元细胞，持续性感染损伤将会影响正常功能。六、细胞抗病毒的RNA干扰RNA干扰（RNA

interference,RNAi）是指细胞利用内源或外源的小分子双股RNA片段，特异性地降解同源基因的mRNA，从而导致靶基因转录后基因沉默（post

translationalgene

silence,PTGS）的现象。人工合成小分子干扰RNA（siRNA）用于转染细胞，可以起到抗病毒感染的作用。七、病毒的干扰现象1、病毒的干扰（Interference）病毒感染的细胞能抵抗相同或不同病毒的再次感染，称为病毒的干扰。干扰具有两种主要的机制：一是由缺陷型突变株所致，通常干扰同源病毒，另一是由干扰素(interferon，IFN)介导。干扰现象除了在不同种病毒之间发生，也可在同种或同型或同株的病毒间发生。干扰现象不仅可在活病毒之间发生，灭活病毒也能干扰活病毒。2、干扰素（Interferon，IFN）干扰素是正常细胞在病毒等适宜诱生剂的作用下所产生的一种生物活性物质，其本质是糖蛋白，因其最初发现具有干扰病毒复制的功能，故称为干扰素。自1957年，Isaac等人发现干扰素以来，一直受到医学界和生物学界的极大重视，并对医学和生物学的研究以