口蹄疫病毒P1结构蛋白和3A非结构蛋白研究进展

口蹄疫病毒1结构蛋白和3A非结构蛋白研究进展姚怀;赵毅;李金;刘宏;任方;黄炯【摘要】口蹄疫病(FMDV)P1因所码的构白是FMV衣的主蛋白,是其要抗位所在区域,决定着FDV的抗原性,3A非结构蛋白能与宿主细胞结,其特征性变化与病毒的表型变化密切相,影响着宿主嗜性和致病,P1和3A基因都是FMDV研究的热论文综述了FMDVP1和3A基及所码蛋的构原性其学能究状,为后续MV研提考.【刊称】《动物进》【年(卷),期】207(3806【总页】5页P6-0)【键】口蹄疫毒;P1结构蛋白;3A非结构蛋白;抗原特性【作者】姚怀兵;赵毅;李金娜;刘宏;任方;黄炯【作者单位新疆农业大学动物医学学,新疆乌鲁木齐830052;天康生物股有限司,新疆乌齐830000;新疆农业大学物医学院,新疆乌木齐830052;天康生物股份有限公司,新疆乌鲁木齐830000;天康生物股份有限公司,新疆乌鲁木齐830000;新疆畜牧科学院兽医研究所,新疆乌鲁木齐830000【正文语种中文【中图分类S852.659.6口蹄疫病(Foot-and-mouthdiseaseviru，FMDV)属小NA病毒科(Picornaviridae口蹄疫病毒(Aphthovirus，是无囊膜病毒，其基因组为一条单股线状的正链，约由8500bp是V础[1-2]。FMDV的病毒粒子由外层的衣壳和里面的RA两部分所构成，其基因组的中部有一个大的开放阅读(ORF，能编病毒多聚白，聚白经级裂解成为P1结构和P2、P3非结白二为1A、1B、1C、1D、2、2B、2C和3A、B、3C、3D，再经三级裂解为VP0或VP4、VP、VP3、VP1(P1基因编码，3～4种结构蛋白La、Lb、2A、2B、2C(P2基因编码)和3A、3B、3C、3D(P3区)8～9种非结构蛋白；三级裂解完成后，P1结构蛋白最终裂解为VP1、VP2、VP3和4，这4结蛋是成FDV衣壳主结构[3]。其中，结构蛋白VP1、VP2、VP3是成病衣壳主要蛋白，是最要的原蛋白[4-5]，其大多数抗原位(antigeiceptope)都位于FMV壳蛋上，定着FMDV对主的原性免疫性。3A基因位于FMDV非结构蛋白3一保基，病毒NA整个复制过程。已有研究表明，3A基因可能决定着宿主特异性和FMDV的毒力，它在进化过程中所发生的变异与宿主动物对病毒的选择优势相关[6。为此，本文对P1结和3A非结构蛋白的结构、功能及其在研制新型疫苗中的作用进行综述，旨在为FMDV基因组的研究提供参考。1.1FMDVP1结白FMDVP1区约2200bp，依次编码85、218、220、213氨酸数量结多，次成1A(V4)、1B(VP2)、1C(VP3)和1D(VP1)4种结构蛋白[7。研究者已经对不同毒株FMDV的核苷酸和氨基酸序列进行了同源性分析，表明VP1具有血清型的特异性，是所有基因中最容易发生变异的一段区域。目前，对FMDV的分型主要是由VP1基因的遗传衍化关系所决[8。VP1基因编码的1D蛋白与1A、1B、1C其他3种结构蛋白各60拷数呈称的20面体结构，共同组成FMDV的衣壳，其中1D蛋白大部分暴露于FMDV衣壳粒子外面，是诱导机体产生中和抗体的主要抗原，也是决定FMDV抗原的主要成分。VP1V2、VP3位于FMDV衣粒子表面大部分VP4则埋在衣壳的内部，位于VP2和VP3之间，在其N端含有1个十四碳酸1、VP2和V3有着极其似的构，均呈形由8股β叠和2个α旋组成圆筒状组成每股β叠片是由2个4条链组的β片结构组，可依被划分为、B和C3个功能区。β片层结构相连的环和C端位于衣壳的表面N端位于衣壳的内侧，这些环形结构和C末端在一定程度上与FMDV的抗原结构有很大的联系。这4种结构蛋白参与、决定着FMDV的免疫原性，是研究FMDV免疫原性及研发新型疫苗的基础。1.2FMDV3A非结构蛋白FMDV非结构蛋白3A位于高度保守的P3结白区有459个核苷酸，编码153个氨基酸，具有疏水基，能与宿主细胞相结合，在正链RA起把VPg锚定在细胞膜上，并能诱发细胞内的膜继续增生3A蛋白前半部分的保守序列形成了以α螺旋为主的二级结构，后半部则为无规则卷曲。它的C段易突变，其它区变异呈零星散在。张显升[9认为3A蛋白的特征性变化可能与FMDV的表型变化具有一定的相关性。由此可以推论FMDV的宿主嗜性和致病力与其3A蛋白的结构密切相关。1.3FMDVP1和3A因抗位点O型FMDV主要有5个抗原位点，其中有3个抗原位点分布在VP1上，VP1上的第140-160和200-213位氨基酸残基是V为B的点1是V最要抗位点之一由H环(122-157aa)和C端(200-213aa氨基酸残基线型表位组成，可以诱导动物产生中和抗体，缺失了会损失疫苗的免疫原性。在决定FMDV的免疫原性和抗原性方面具有重要作用；抗原位点2和4分别由VP2白BC环、EF环和VP3蛋白β-B“球形结节”中的一些氨基酸残基所构成，它们多以VP1-VP3交汇点为中心，散在地分布于20面的重附近[10]；抗原位点3位于病毒粒子表面五重轴的βB-C点5于H环内，与抗原位点1相互独立[11]。从病毒的拓扑结构上来说，抗原位点1、2和3都独立，原位点2和4是相关联的抗位点2～5均由不连续的抗原表位构成，具有构象依赖性，而抗原位点1中的抗原表位不具有这种构象依赖性的特点Grazioli等[12]研究比对分析，发现不同型FMDV的抗原位点均包含有VP1蛋白H环和C端、VP2蛋白B-C环、VP3蛋白部分环中的残基，同时各型之间存在部分氨基酸残基的替换、插入或缺失，肽链之间作用方式的也有所不同，造成了它们相对应抗原位点构象的差异性。WuQ等[13]把FMDV的1插体毒化胞中，FMDVP1结蛋被工成VP0、VP1和VP3蛋白此重载体入动物，诱导机产生中和抗，其度与品疫和单价组载产生中和抗的滴度相比低。FMDV在疫系选择点中有4个发挥键作用抗原位，位于VP1第83位、VP2第79位3第5、70位。Borley等[14-15利用FMDV三维结构学建立了一种抗原表位预测方法，能够准确预测出多个FMDV新的抗原表位。P1基因在免疫原性和遗传性方面所具有重要的特点，对其更深入地研究，可以更清楚FMDV的抗原结构特征，也能为FMD流行病学、毒株演化关系和基因工程疫苗奠定基础，所以倍受国内外研究者的关注。3A非结构蛋白上也有很多抗原表位，主要集中在羧基端，这些抗原表位与相应抗体的结合能力[16-17]，通过对抗原分子表位的研究，能够深入了解FMDV抗原的结构和功能、免疫机理，为制备新型FMD疫苗以及建立可靠的诊断方法奠定基础。2.11D基因编码产物VP1的功能在FMDV结构基因中，VP1基因因其具有血清型特异性，是FMD病毒株遗传特性及其比较分析的首选基因。目前许多国家在FMD分子流行病学调查研究中，利用VP1基因的核苷酸序列测定和分析比较毒株间的同源性。因此，研究VP1基因为FMD流行病学调查研究、疫源的追踪、毒株的进化分析提供理论基础。同时，VP1也是决定FMDV抗原性的主要成分，其氨基酸的第21-40位重的T胞抗第1410位第200-213位氨基残基主的B细胞抗表位，能诱动产生和抗，护动抵抗FDV的染，是原性高区[18]。VP1已被确定为是诱导产生中和抗体的主要免疫原性位点，是研制口蹄疫表位疫苗的首选基因，包含有VP1段多肽的口蹄疫合成肽疫苗能产生良好的免疫应答，并且已获得国家批[19]。石庆伟等[20]通过对FMDV样品VP1基因进行实验室检测与分析研究，推导出样品中的FMDV所属的谱系；对其核苷酸进行同源性分析，推导出了与已知同源性最高的毒株；又对其氨基酸变异位点进行比对分析，找出了FMDV样品1中VP1基因的高突变区，可以为了解FMDV流行地区的遗传变异情况，为疫苗的合理选择、疫情预测和防治措施的制定提供数据支持。刘亚丽[21]对南非型口蹄疫病毒的VP1基因序列及其编码的氨基酸序列进行了比对分析，确定了VP1上含有高保守性的能与宿主细胞受体结合的位点D基序，在病毒入侵和免疫保护的过程中起着重要作用。其研究还证明了145(N)、152(D)、158(Q、218(A位是O型FMDV抗原位点1的关键氨基酸。FMDV上VP1主要原位点所位置虽然似，但如果关键性氨基发生变化对病毒抗原性及疫原性均成了重要响。分析VP1的高变异区对FV遗传异病究型研有要意。22C基因码物P3的能VP3蛋白位于FMDV粒子的衣壳表面，因具有无规则卷曲的柔性特点，从空间形态上调整为不同的构象，在物理形态上、生化性质上表现出可动性和多功能性，很大程度上增加了FMDV的抗原性[22]。研究表明VP3蛋白上的第6位残的精氨酸(Ar病别酰体决作。VP3蛋白A功能区上的游离多肽链和B功能区的折叠桶均能成为机体产生的多克隆抗体所攻击的靶标[23]。总体上说，VP3蛋白具有数量较多的、分段的抗原决定簇，是构成FMDV衣壳表面的重要组成抗原，也是主要引起机体产生免疫攻击的对象，在FMDV侵袭、复制的过程中影响着病毒衣壳组装和分解。2.31B基因编码产物V2的功能FMDVVP2可以诱导机体产生特异性的抗体，具有良好的抗原性和保守型，可以作为抗原检测FMDV的抗体具有一定的优[24]。张润祥等[25]利用表达出的VP2重组蛋白，建立了一种间接EISA方，良特性感为检测牛FD免体感体供种有的法。2.41A基因编码产物4能FMDVVP4蛋白具高度主要织相容复合体(MHC的复杂性，在不同血清型中不发生变异，具有高度保守性VP4有主要的T细胞表位，在T细胞免疫应答中发挥决定性作[26]。VP4蛋白还能诱导动物机体产生中和抗体，完整的FMDV粒子和空壳体都具有免疫原性，而衣壳微体没有免疫原性是因为缺少V4。为VP1与V4蛋共成体时刺体强的体液疫免应其原性[27]。VP4碳缠在VP3的N端，对FMDV结构的装配和稳定也具有重要作用。虽然目前对FMDV抗原结构、功能的研究还不充分，但仍取得了一些结果，找出了FMDV本身所具备的一些的特征。在FMDVP1基因的4种构，VP1变异性最大VP2较为保守，VP4是最为保守的蛋[28]；VP1蛋白自身单独不能诱导机体产生像完整的病毒衣壳蛋白一样诱导机体产生的健全的、较强的免疫应答反应，它必须与VP2、VP3和VP4蛋白结合成相对完整的病毒衣壳结构才能达到理想的免疫效[29]。大多数病毒的侵袭都依赖于易感细胞膜上的特异性受体，而FMDV的入侵主要是由具有内吞作用的依赖整联衣壳蛋白和依赖硫酸乙酰肝素[30]。将FMDV的保护性1因到病菌物的组中定可效重白进活疫此，FV有点在1，然接诱似毒的抗免，含1长基疫对防FV阔前景。3A基因是一种非结构蛋白，它参与RNA的整个复制过程，是一段高度保守的区域。已有研究表明，3A基因在对适应宿主的特异性和毒力方面具有关键的作用，3A上一些关键性氨基酸的变异或缺失，能导致宿主范围的改变。因此3A基因氨基酸的变异与病毒对宿主的选择具有优势相关[31]。不同宿主适应性FMDV的非结构蛋白在3A基因水平上表现出了极大的差异FMDV对宿主的嗜性、致病力与3A基因的变异具有密切的联[32]。Jackson对不毒株的FDV的3A基因群序列比对发现3A基因的发生核苷酸变异的位点很少，而且是零星地散在3A的基因片段上，引起的氨基酸变异位点集中在3A基因的后半[33]。3A基因根据变异情况可以分为前后两段，前半段为N端(1-75位氨基酸具有高度的保守性，是维持FMDV的基础毒力；后半段C端(76-153位氨基，是相对容易发生缺失和变异，在一定程度上能够影响FMDV对不同种宿主的嗜[34]。除此之外，3A基因与其他基因有着协同作用，如3A、3AB都是重要的NA，；2C或3A蛋白上的氨基酸置换与FMDV毒力的修饰、细胞嗜性和宿主范围有关，并且非结构蛋白2C、A和3B是与细胞病理学相关的重要调控因子等。周强[35]研究对来自不同宿主的Mya98系毒进行病毒子特征分析蚀斑型的较，非结蛋白3A、2C和3B上现具重要意义的8个氨基酸的变异位，结果明像3A这类非结构蛋白的特定的关键性氨基酸变异会对其编码蛋白的功能产生相应的影响，从而改变了对蚀斑的显型。Pacheco等[36]研究表明3A蛋白的87-106位氨基酸缺失后对宿主的嗜性造成了影响，证明了3A蛋白部分基因的缺失能够降低病毒对牛的致病力。随后有研究进一步证实3A蛋白93-102位缺失是一种对牛致弱性的变异，并且首次提出了3A蛋白93-102位的氨基缺失非完全定FDV的宿嗜性，3A蛋白上其他区域也对宿主的嗜性起到一定的影响作[37]。最近，美国梅岛中心的研究发现，3A蛋白能与宿主蛋白DCTN3相，且促进DV的，已生变的3A蛋白则不能与CT3相结，3A蛋白能直接影响FMDV的复制能力[38-40。因此，对A蛋。P1基的蛋不型的也是FV要位所在域。P1基异研得行株匹，及时疫，产保障MD苗的为的技术指标[41]。ZhangZ[42]基于VP1抗原位点3A的抗原表位和3D蛋白，设计了3种合成肽疫苗，结果表明3种合成肽疫苗均使乳鼠、牛产生了抗病毒的中和抗体3A基因及其编码的非结构蛋白，前半段具有高度保守性，后半段能够影响FMDV毒株对其宿主的嗜性，对病毒适应不同宿主具有重要意义。因此，研究FMDV基因组的结构蛋白和非结构蛋白在病毒装配和分解过程中发挥的作用，能够更清楚FMDV生物学特性和病毒的增殖机理，对开展免疫学、诊断技术以及新型疫苗的研究具有重要作用。【相关文献】[1]刘运超，冯丽丽，赵宝磊，等.O型口蹄疫病毒VP3蛋白的可溶性表达与反应原性分析[J].河南农业科学，2015，44(11):124-128.[2]JamalSM,BelshamGJ.Foot-and-mouthdisease:past,presentandfuture[J].VetRes,2013,44(44):1-14.[3]JoshiG,SharmaR,KakkerNK.PhenotypicandfunctionalcharacterizationofT-cellsandinvitroreplicationofFMDVserotypesinbovinelymphocytes[J]Vaccine,2009,27(48):6656-61.[4]RobinsonL,Knight-JonesTJD,CharlestonB,etal.Globalfoot-and-mouthdiseaseresearchupdateandgapanalysis:7-pathogenesisandmolecularbiology[J].TransbEmergDis,2016,63(S):63-71.[5]ZhengC,WangH,ZhouG,etal.Adenovirus-vectoredtypeAsia1foot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)capsidproteinsasavehicletodisplayaconserved,neutralisingepitopeoftypeOFMDV[J].JVirolMeth,2013,188(1-2):175-182.[6]薛青,刘湘涛.口蹄疫病毒3A基因在大肠杆菌中的高效表达[J].微生物学报,2002,42(5):539-542.[7]廖德,李华春.口蹄疫病毒结构蛋白P1研究进展[J].动物医学进展,2007,28(8):23-26.[8]刘亚,丁耀忠,马小元,等.南非型口蹄疫病毒VP1基因的核苷酸及其氨基酸序列分析[J].黑龙江畜牧兽医,2016(9):8-9.[9]张显,赵启祖,刘在新,等.口蹄疫病毒株China/99P3区一级结构及与参考毒株的比较分析[J].畜牧兽医学报,2002,33(6):606-610.[10]MaXQ,LIPH,BAIXW,etal.Sequencesoutsidethatofresidues93-102of3Aproteincancontributetotheabilityoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)toreplicateinbovinederivedcells[J].VirusRes,2014,191:161-71.[11]LefebvreJ,DeVleeschauwerAR,GorisN,etal.Proofofconceptfortheinhibitionoffoot-and-mouthdiseasevirusreplicationbytheanti-viraldrug2′-C-methylcytidineinseverecombinedimmunodeficientmice[J].TransboEmergDis,2014,61(6):e89-e91.[12]GrazioliS,FallacaraF,BrocchiE.Mappingofantigenicsitesoffoot-and-mouthdiseasevirusserotypeAsia1andrelationshipswithsitesdescribedinotherserotypes[J].JGenVirol,2013,94(Pt_3):559-569.[13]WuQ,MoraesP,GrubmanMJ.Recombinantadenovirusco-expressingcapsidproteinsoftwoserotypesoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV):invitrocharacterizationandinductionofneutralizingantibodiesagainstFMDVinswine[J].VirusRes,2003,93(2):211-219.[14]AlamSM,AminR,RahmanMZ,etal.AntigenicheterogeneityofcapsidproteinVP1infoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)serotypeAsia1[J].AdvApplBioinformatChem,2013,6(1):37-46.[15]BorleyDW,MahapatraM,PatonDJ,etal.Evaluationanduseofin-silicostructure-basedepitopepredictionwithfoot-and-mouthdiseasevirus[J].PLoSOne,2013,8(5):e61122.[16]LiP,BaiX,CaoY,etal.Expressionandstabilityofforeignepitopesintroducedinto3Anonstructuralproteinoffoot-and-mouthdiseasevirus[J].PLoSOne,2012,7(7):3597-3610.[17]王娜,卢曾军,曹轶梅,等.一株口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的表位肽段鉴定[J].动物医学进,2014(10):7-9.[18]DomingoE,EscarmSC,BaranowskiE,etal.Evolutionoffoot-and-mouthdiseasevirus[J].VirusRes,2003,91(1):47-63.[19]李图帅,陈瑾,乔绪稳,等.利用霍乱毒素B亚单位展示猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白主要抗原表位[J].江苏农业学报,2016,32(3):601-607.[20]石庆伟,冯嘉,陈耀,等.5株口蹄疫病毒VP1和3A基因的序列分析[J].中国预防兽医学报,2016,38(8):23-26.[21]刘亚丽,丁耀,马小元,等.口蹄疫病毒的抗原结构学的研究进展[J].中国预防兽医学报,2016,38(3):253-256.[22]周建华,丛国,高闪电,等.FMDVOA/58病毒株VP3蛋白结构的模拟与分析[J].华北农学,2008,23(6):28-31.[23]曲哲会,王君,郭晓秋,等.口蹄疫病毒VP2基因的原核表达及抗原性检测[J].中国预防兽医学报,2007,29(2):91-95.[24]LiminLI,WangY,CuiB,etal.TheeffectivenessofmastcellpatternrecognitionofrecombinantVP1-VP4offoot-and-mouthdiseasevirus[J].ActaVetEtZootechnicaSinica,2015.[25]张润祥,高明,曲哲会,等.牛口蹄疫病毒VP2结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立[J].中国预防兽医学报,2010,32(2):68-68.[26]陈启伟,王永,张永光,等.口蹄疫病毒株AF72VP3的结构模拟与分析[J].华北农学报,2009,24(4):1716-1722.[27]AshkaniJ,ReesD.ThecriticalroleofVP1informingthenecessarycavitiesforreceptor-mediatedentryofFMDVtothehostcell[J].SciReports,2016,6.[28]GaoY,SunSQ,GuoHC.BiologicalfunctionofFoot-and-mouthdiseasevirusnon-structuralproteinsandnon-codingelements[J].VirolJ,2016,13(1):1-17.[29]ChitrayM,BeerT,VoslooW,etal.GeneticheterogeneityintheleaderandP1-codingregionsoffoot-and-mouthdiseasevirusserotypesAandOinAfrica[J].ArchVirol,2014,159(5):947-961.[30]李夏莹,郑鹭,张秀杰,等.口蹄疫病毒研究进展[J].中国畜牧兽医,2015,42(7):1910-1916.[31]薛青红,刘湘.口蹄疫病毒3A基因在大肠杆菌中的高效表达[J].微生物学报,2002,42(5):539-542.[32]GurumurthyCB,SanyalA,VenkataramananR,etal.GeneticdiversityintheVP1geneoffoot-and-mouthdiseasevirusserotypeAsia1[J].ArchVirol,2002,147(1):85-102.[33]MaX,LiP,SunP,etal.Constructionandcharacterizationof3A-epitope-taggedfoot-and-mouthdiseasevirus[J].InfGenEvolJMolEpidemiolEvolGenInfDis,2015,31C:17-24.[34]DasB,MohapatraJK,PandeV,etal.Evolutionoffoot-and-mouthdiseasevirusserotypeAcapsidcoding(P1)regiononatimescaleofthreedecadesinanendemiccontext[J].InfGenEvol,2016,41:36-46.[35]周强,包慧芳,白兴文