细胞增殖检查操作SOP

细胞增殖检查操作SOP编号：SOP-ZL001-00页码：1\4版本号：01修订号：00机密等级：秘密起草人起草日期颁发部门质量管理部审核人审核日期批准人批准日期生效日期分发清单研发部[]质量管理部[]综合管理部[]生产管理部[]市场销售部[]财务部[]目的为了规范细胞培养岗位人员在新生牛血清支持细胞增殖检查过程中的标准操作。适用范围本规程适用新生牛血清支持细胞增殖检查。职责3.1．细胞培养岗位人员：负责严格按照本标准操作规程进行操作。3.2．细胞组长：检查细胞组人员的生产操作情况，确保操作的正确性。3.3．质量管理员：监督、检查本文件的执行情况。术语无材料及设备5.1高压蒸汽灭菌物品：250mL瓶、500ml瓶、3L瓶、10ml吸管、橡胶塞、分装管道、C级洁净服级口罩。5.2消毒剂：1﹪（ml/ml）来苏儿、5﹪（ml/ml）来苏儿、1‰（ml/ml）新洁尔灭、5‰（ml/ml）新洁尔灭。5.3无菌液体：0.25%胰蛋白酶、8.0%（g/ml）碳酸氢钠、对照新生牛血清、待检新生牛血清、3.0%谷氨酰胺、E-MEM培养基。5.4设备、设施：确认设备、设施处于清洁完好状态，并在验证有效期内。5.5其他物品：止血钳、斜面架、吸球、医用手套。6内容6.1第一次细胞传代6.1.1生产前检查6.1.1.1工作环境确认：细胞制备间：在C级局部A级洁净区内进行，温度控制在15～26℃,相对湿度控制在30～70%，。确认场地清场合格，无上批次生产遗留物，将清场合格证贴在本批次记录内。6.1.1.2设备、设施确认：（1）按照《倒置显微镜使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认倒置显微镜处于完好状态。（2）按照《培养箱管理标准操作规程（使用、清洁消毒、维护、保养）》确认培养箱运行状态良好。（4）按照《转瓶机使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认转瓶机处于完好状态。（5）按照《洁净工作台使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认层流罩处于完好状态。（6）确认上述设备、设施均在清洁、消毒有效期内。6.1.1.3文件记录检查确认本操作标准操作规程、辅助记录和所用的标签、状态卡已经到位。6.1.1.4消毒剂确认确认1‰新洁尔灭、5‰新洁尔灭、1﹪来苏儿水和5﹪来苏儿水的批号和有效期。6.1.2操作前准备：按照规程要求准备相应物品。6.1.2.1无菌液体确认：从低温冰箱中取出3.0%谷氨酰胺、对照新生牛血清、待检新生牛血清、核实名称、来源、批号、有效期后放入液体融化间待用；8.0%（g/ml）碳酸氢钠、E-MEM培养基核对名称，批号，有效期；所有无菌液体瓶用1‰（ml/ml）新洁尔灭或1﹪（ml/ml）来苏儿水擦外表面，经缓冲间进入C级区。6.1.2.2细胞确认：确认细胞代次、瓶型、数量及日龄及生长情况。6.1.3生产操作6.1.3.1液体配制操作前30分钟打开层流罩，日光灯。（1）消化液：以400ml体积装量的浓度为0.25﹪胰蛋白酶为基质液，加入2.0﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氢钠），盖橡胶塞摇匀待用。（2）生长液：86.9﹪（ml/ml）E-MEM+10﹪（ml/ml）对照新生牛血清（或待检新生牛血清）+0.9﹪（ml/ml）（3.0﹪谷氨酰胺）+2.2﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氢钠）。按配方计算出配置一定体积的复苏液所需E-MEM、3.0﹪谷氨酰胺、8.0﹪碳酸氢钠、对照新生牛血清及待检新生牛血清的体积；用10ml吸管抽取对应体积的各种液体加入E-MEN培养基中，盖橡胶塞摇匀待用。6.1.3.2消化：弃3L瓶内生长液，每3L瓶加20～30ml消化液，置转瓶机上，调整转数为70～90转/小时，待细胞面呈松散状时弃消化液。6.1.3.3传代：将消化好的细胞加入生长液，每3L瓶加入200ml生长液悬浮细胞，摇动3L瓶，使细胞从瓶壁上脱落悬入生长液中，按1：4分种率将细胞悬液分种于其它3L瓶中,每个3L瓶补加生长液至400ml～600ml。6.1.3.4培养：将3L瓶内细胞悬液沿瓶壁摇匀，置转瓶机上旋转培养，转数20～30转/小时，将转瓶机置于37℃±0.5℃恒温室培养，注明细胞代次、传代日期、待检血清和对照血清的批号及厂家。6.1.3.5操作过程中出现偏差的情况按照《偏差管理标准操作规程》进行处理。6.1.4清场：6.1.4.1在生产完成后清场操作前需在房间门上悬挂“待处理”标志牌，关闭层流罩，日光灯。6.1.4.2按《生产区清场、清洁、消毒管理标准操作规程》对操作区域进行清洁、消毒。6.1.4.3集液槽用5‰（ml/ml）新洁尔灭或5﹪（ml/ml）来苏儿溶液清洗消毒及液封。6.1.4.4废弃物装袋放固定位置送出。6.1.4.5按要求正确悬挂状态标识。6.1.5待检血清培养细胞观察观察细胞形态是否为典型成纤维状细胞、细胞是否贴壁、伸展连网、有无污染以及是否光亮透明。于传代后第一天、第四天及第六天各观察一次，并记载。6.1.6及时填写《新生牛血清支持细胞增殖检查记录》。6.2第二次细胞传代6.2.1生产前检查6.2.1.1工作环境确认：细胞制备间：在C级局部A级洁净区内进行，温度控制在15～26℃,相对湿度控制在30～70%，。确认场地清场合格，无上批次生产遗留物，将清场合格证贴在本批次记录内。6.2.1.2设备、设施确认：（1）按照《层流罩使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认层流罩处于完好状态。（2）按照《倒置显微镜使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认倒置显微镜处于完好状态。（3）按照《恒温室管理标准操作规程（使用、清洁消毒、维护、保养）》确认恒温室运行状态良好。（4）按照《转瓶机使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认转瓶机处于完好状态。（5）确认上述设备、设施均在清洁、消毒有效期内。6.2.1.3文件记录检查确认本操作标准操作规程、辅助记录和所用的标签、状态卡已经到位。6.2.1.4消毒剂确认6.2.2操作前准备：按照规程要求准备相应物品。6.2.2.1无菌液体确认：从低温冰库中取出3.0%谷氨酰胺、对照新生牛血清、待检新生牛血清、核实名称、来源、批号、有效期后放入液体融化间待用；8.0%（g/ml）碳酸氢钠、E-MEM培养基核对名称，批号，有效期；所有无菌液体瓶用1‰（ml/ml）新洁尔灭或1﹪（ml/ml）来苏儿水擦外表面，经缓冲间进入C级区。6.2.2.2细胞种子确认：确认细胞代次、瓶型、数量及日龄及生长情况。6.2.3生产操作6.2.3.1液体配制操作前30分钟打开层流罩，日光灯。（1）消化液：以400ml体积装量的浓度为0.25﹪胰蛋白酶为基质液，加入2.0﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氢钠），盖橡胶塞摇匀待用。（2）生长液：86.9﹪（ml/ml）E-MEM+10﹪（ml/ml）对照新生牛血清（或待检新生牛血清）+0.9﹪（ml/ml）（3.0﹪谷氨酰胺）+2.2﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氢钠）。按配方计算出配置一定体积的复苏液所需E-MEM、3.0﹪谷氨酰胺、8.0﹪碳酸氢钠、对照新生牛血清及待检新生牛血清的体积；用10ml吸管抽取对应体积的各种液体加入E-MEN培养基中，盖橡胶塞摇匀待用。6.2.3.2消化：弃3L瓶内生长液，每3L瓶加20～30ml消化液，置转瓶机上，调整转数为70～90转/小时，待细胞面呈松散状时弃消化液。6.2.3.3传代：将消化好的细胞加入生长液，每3L瓶加入200ml生长液悬浮细胞，摇动3L瓶，使细胞从瓶壁上脱落悬入生长液中，按1：4分种率将细胞悬液分种于其他3L瓶中，每个3L瓶补加生长液至400ml～600ml。6.2.3.4培养：将3L瓶内细胞悬液沿瓶壁摇匀，置转瓶机上旋转培养，转数20～30转/小时，将转瓶机置于37℃±0.5℃恒温室培养，转瓶机上贴好标签，注明细胞代次、传代日期、待检血清和对照血清的批号及厂家。6.2.3.5操作过程中出现偏差的情况按照《偏差管理标准操作规程》进行处理。6.2.4清场：6.2.4.1在生产完成后清场操作前需在房间门上悬挂“待处理”标志牌，关闭日光灯。6.2.4.2按《生产区清场、清洁、消毒管理标准操作规程》对操作区域进行清洁、消毒。6.2.4.3集液槽用5‰（ml/ml）新洁尔灭或5﹪（ml/ml）来苏儿溶液清洗消毒及液封。6.2.4.4废弃物装袋放固定位置送出。6.2.4.5按要求正确悬挂状态标识。6.2.5待检血清培养细胞观察观察细胞形态是否为典型成纤维状细胞、细胞是否贴壁、伸展连网、有无污染以及是否光亮透明。于传代后第一天、第四天及第六天各观察一次，并作详细记录。6.2.6及时填写《新生牛血清支持细胞增殖检查记录》。6.3第三次细胞传代6.3.1生产前检查6.3.1.1工作环境确认：细胞制备间（一）在C级局部A级洁净区内进行，温度控制在15～26℃,相对湿度控制在30～70%，相对压差≥5Pa。确认场地清场合格，无上批次生产遗留物，将清场合格证贴在本批次记录内。6.3.1.2设备、设施确认：（1）按照《层流罩使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认层流罩处于完好状态。（2）按照《倒置显微镜使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认倒置显微镜处于完好状态。（3）按照《恒温室管理标准操作规程（使用、清洁消毒、维护、保养）》确认恒温室运行状态良好。（4）按照《转瓶机使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认转瓶机处于完好状态。（5）确认上述设备、设施均在清洁、消毒有效期内。6.3.1.3文件记录检查确认本操作标准操作规程、辅助记录和所用的标签、状态卡已经到位。6.3.1.4消毒剂确认确认1‰新洁尔灭、5‰新洁尔灭、1﹪来苏儿水和5﹪来苏儿水的批号和有效期。6.3.2操作前准备：按照规程要求准备相应物品。6.3.2.1无菌液体确认：从低温冰库中取出3.0%谷氨酰胺、对照新生牛血清、待检新生牛血清、核实名称、来源、批号、有效期后放入液体融化间待用；8.0%（g/ml）碳酸氢钠、E-MEM培养基核对名称，批号，有效期；所有无菌液体瓶用1‰（ml/ml）新洁尔灭或1﹪（ml/ml）来苏儿水擦外表面，经缓冲间进入C级区。6.3.2.2细胞种子确认：确认细胞代次、瓶型、数量及日龄及生长情况。6.3.3生产操作液体配制6.3.3.1操作前30分钟打开层流罩，日光灯。（1）消化液：以400ml体积装量的浓度为0.25﹪的胰蛋白酶消化液为基质液，加入2.0﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氢钠），盖橡胶塞摇匀待用。（2）生长液：86.9﹪（ml/ml）E-MEM+10﹪（ml/ml）对照新生牛血清（或待检新生牛血清）+0.9﹪（ml/ml）（3.0﹪谷氨酰胺）+2.2﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氢钠）。按配方计算出配置一定体积的复苏液所需E-MEM、3.0﹪谷氨酰胺、8.0﹪碳酸氢钠、对照新生牛血清及待检新生牛血清的体积；用10ml吸管抽取对应体积的各种液体加入E-MEN培养基中，盖橡胶塞摇匀待用。6.3.3.2消化：弃3L瓶内生长液，每3L瓶加20～30ml消化液，置转瓶机上，调整转数为70～90转/小时，待细胞面呈松散状时弃消化液。7.3.3.3传代：将消化好的细胞加入生长液，每3L瓶加入200ml生长液悬浮细胞，摇动3L瓶，使细胞从瓶壁上脱落悬入生长液中，按1：4分种率将细胞悬液分种于其他3L瓶中，每个3L瓶补加生长液至400ml～600ml。6.3.3.4培养：将3L瓶内细胞悬液沿瓶壁摇匀，置转瓶机上旋转培养，转数20～30转/小时，将转瓶机置于37℃±0.5℃恒温室培养，转瓶机上贴好标签，注明细胞代次、传代日期、待检血清和对照血清的批号及厂家。6.3.3.5操作过程中出现偏差的情况按照《偏差管理标准操作规程》进行处理。6.3.4清场：6.3.4.1在生产完成后清场操作前需在房间门上悬挂“待处理”标志牌，关闭层流罩，日光灯。6.3.4.2按《生产区清场、清洁、消毒管理标准操作规程》对操作区域进行清洁、消毒。6.3.4.3集液槽用5‰（ml/ml）新洁尔灭或5﹪（ml/ml）来苏儿溶液清洗消毒及液封。6.3.4.4废弃物装袋放固定位置送出。6.3.4.5按要求正确悬挂状态标识。6.3.5待检血清培养细胞观察观察细胞形态是否为典型成纤维状细胞、细胞是否贴壁、伸展连网、有无污染以及是否光亮透明。于传代后第一天、第四天及第六天各观察一次，并作详细记录。6.3.6及时填写《新生牛血清支持细胞增殖检查记录》6.4第四次细胞计数6.4.1生产前检查6.4.1.1工作环境确认：细胞制备间（一）：在C级局部A级洁净区内进行，温度控制在15～26℃,相对湿度控制在30～70%，相对压差≥5Pa。确认场地清场合格，无上批次生产遗留物，将清场合格证贴在本批次记录内。6.4.1.2设备、设施确认：（1）按照《层流罩使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认层流罩处于完好状态。（2）按照《倒置显微镜使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认倒置显微镜处于完好状态。（3）按照《恒温室管理标准操作规程（使用、清洁消毒、维护、保养）》确认恒温室运行状态良好。（4）确认上述设备、设施均在清洁、消毒有效期内。6.4.1.3文件记录检查确认本操作标准操作规程、辅助记录和所用的标签、状态卡已经到位。6.4.1.4消毒剂确认确认1‰新洁尔灭、5‰新洁尔灭、1﹪来苏儿水和5﹪来苏儿水的批号和有效期。6.4.2操作前准备：按照规程要求准备相关物品。6.4.2.1无菌液体确认：从低温冰库中取出3.0%谷氨酰胺、对照新生牛血清、待检新生牛血清、核实名称、来源、批号、有效期后放入液体融化间待用；8.0%（g/ml）碳酸氢钠、E-MEM培养基核对名称，批号，有效期；所有无菌液体瓶用1‰（ml/ml）新洁尔灭或1﹪（ml/ml）来苏儿水擦外表面，经缓冲间进入C级区。6.4.2.2细胞种子确认：确认细胞代次、瓶型、数量及日龄及生长情况。6.4.3生产操作6.4.3.1液体配制操作前30分钟打开层流罩，日光灯。（1）消化液：以400ml体积装量的浓度为0.25﹪胰蛋白酶为基质液，加入2.0﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氢钠），盖橡胶塞摇匀待用。（2）生长液：86.9﹪（ml/ml）E-MEM+10﹪（ml/ml）对照新生牛血清（或待检新生牛血清）+0.9﹪（ml/ml）（3.0﹪谷氨酰胺）+2.2﹪。（ml/ml）（8.0﹪碳酸氢钠）按配方计