致病基因定位与克隆培训课件

基因定位或基因制图(genemapping)：人类的基因定位或基因制图(genemapping)是近年来发展最快的领域之一。它的目的在于决定不同的基因在染色体上的位置。一条染色体是一条独立的DNA链，同一条染色体上的基因在该染色体上呈线性排列。人类的20000-25000个基因分布在24种染色体上，它们在染色体上的位置可通过两种制图方法来表示：

1、物理图谱(physicalmap)，即确定基因之间的绝对物理学距离，通常用Mb(百万碱基对)或Kb(千碱基对)来表示

2、遗传图谱(geneticmap)，即确定基因之间的遗传学距离，用cM(Centimorgen分摩)表示。定义基因克隆：基因克隆通常涉及到将构成某一基因的基因组DNA(genomicDNA,gDNA)或互补DNA(complementaryDNA,cDNA)插入某一载体内，利用载体在宿主细胞(通常用大肠杆菌)中大量繁殖而获得该基因的足够量的拷贝，以便于进行基因的结构和功能的分析，广义的基因克隆也包括任何使基因或DNA片段扩增的操作。现代医学遗传学最重要的目的就是确定某一基因突变与某一疾病之间的因果关系，了解其致病机理，为疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。而确定某一基因突变与某一疾病之间的因果关系的最重要的手段之一就是致病基因的克隆。基因定位方法

strategyforgenemapping染色体多态法（chromosomeheteromorphism）染色体畸变法(chromosomeabnormality)体细胞杂种法(somaticcellhybrids)染色体分类法(chromosomesorting)原位杂交法（FISH）剂量分析法(dosageananlysis)测序法（sequencing）家系分析法（pedigreeananlysis）染色体多态法仅限于X染色体上的定位，根据某些性状或疾病在男女性别间的差异，结合系谱分析，将这些基因定位在X染色体上。Duffy血型基因定位于1号染色体上，这是人类第一次将某一特定的基因定位在常染色体上。染色体畸变法畸变常涉及两个位点，如果这两个位点之一正好是某一功能基因所在的位置，染色体的畸变则肯破坏该基因的正常功能而引起疾病，根据染色体畸变的位置和疾病发生的关系，则可将致病基因定位于染色体的某一特定位置上。如DMD基因的定位Xp21。染色体异常进行基因定位---睾丸决定因子Testisdeterminingfactor体细胞杂种法体细胞杂种通常由人和鼠的体细胞融合而成。融合细胞在最初几代培养过程中选择性丢失人类染色体，而保留所有的鼠染色体。保留在融合细胞中的染色体可以是多条，也可能只有一条甚至某条染色体的一部分。根据研究的需要可将含有不同人类染色体的人鼠杂种细胞组合成人鼠杂种细胞板(hybridpanel)，结合杂种细胞板和PCR的方法或基因剂量分析，或蛋白质表达分析，可将相应的基因定位到特定的染色体或染色体片段上，该杂种细胞板在人类基因定位以及人类基因组计划中发挥过重要的作用。原位杂交法（FISH）如果一个基因或基因的某一部分已经被克隆，则可将该基因用同位素或荧光标记和染色体原位的分子杂交，在染色体上恒定出现信号的区域即该基因在染色体上的位置。同一染色体上的多个不同的基因可用不同的荧光标记来鉴别他们在染色体上的相对位置，运用这一方法在中期染色体上，可区分两个相隔约2Mb的基因；在间期染色体上，据称可鉴别仅相隔50kb的两个基因。CONNEXIN31.1除性染色体外，每个人体内的染色体都有两份。一个人所拥有的一对等位位点的类型被称作基因型（genotype）对SNP位点而言，一个人有三种可能性，分别是AA，AG或GG。这种基因型的差异叫做单核苷酸多态性（SNP）通过实验确定某个个体在某个多态性位点的基因型，被称作基因分型基因分型（Genotyping）几种多态标记:（1）RFLPs（2）STRPs（3）SNPs第一代标记：RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism）限制性内切酶可在特定的核苷酸位置切割DNA。DNA序列的改变甚至是一个碱基的改变，都可能改变限制性内切酶酶切片段的长度，通过凝胶电泳可以方便地检测这种长度的“多态性”。RFLP在整个基因组中都存在，根据对RFLP片段的多态性分析，可对某些疾病进行诊断并将与疾病有关的基因进行定位。1980年，Botstein首次提出。使用特殊的外切酶切断DNA中特殊位点1987年，第一张较完整的人基因连锁图，包含393个RFLP位点。缺点：数目少，信息量小；成本昂贵，操作繁琐，不易发展到自动化水平。第二代标记：STR(shorttandemrepeatpolymorphism)

例如基因组中两个或两个以上的核苷酸短串联重复序列(CA)n，微卫星标记等，在不同个体中重复单位的数目变异非常大。微卫星标记荧光电泳图STR广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是2bp-6bp的串联重复，其中以(CA)n，(GT)n常见。1996年建立了以6000多个STR为主体的遗传图谱，目前有10000个左右的位点。主要用于个体识别优点：信息量大；易实现自动化。缺点：标记数量不够多第三代遗传标记：SNP（单核苷酸多态性）随着人类基因组计划、国际人类基因组单体型计划（Hapmap计划）的完成，大量的SNP被发现。利用先进的高通量基因芯片技术，精确揭示重大疾病的基因变异，从而阐明疾病的遗传学发病机制，是目前科学界公认的最为有效的搜寻重大疾病易感基因的研究方法，被Science杂志评为2007年十大科学进展之首。迄今已发现的SNP约900～1,000万个特点：数量丰富双等位标记，简单的+/-分析根据结果可以估算出某个等位基因在一个群体中的频率易于实现自动化，快速筛查SNP作为遗传标记的优势家系分析法基本原理：连锁分析(Linkageanalysis)RFLP、STR、SNP、等。基本的遗传现象—染色体的交换重组在基因病研究中，常用遗传分析都是建立在一种生物现象——染色体重组基础之上的。染色体上的两个位点间相距越远，重组几率越大。我们可以根据标记位点与疾病位点间的重组率估算出两者间的遗传距离及连锁程度。在家系中，重组率是进行连锁分析的基础；123Lodscore的计算Lod>3肯定连锁，Lod<-2否定连锁，

-2<Lod<1则还需增加样本资料。遗传病致病基因克隆目标：现阶段的所谓致病基因的克隆实质上已不是传统意义上的基因克隆而主要是致病基因的鉴定，即将某一特定基因的突变与某一特定的疾病联系起来。

策略：表达克隆(expressioncloning)、CpG岛(CpGisland)、外显子捕获(exontrapping)、gDNA或cDNA消减杂交(gDNAorcDNAsubtractivehybridization)、Zooblot、同源序列(homologoussequence)、染色体显微切割与显微克隆(microdissectionandmicrocloning)、杂交筛选(functionalcloning)、等位基因补救(allelicrescue)、候选基因(candidategene)和位置克隆法(positionalcloning)位置克隆：目前最常用的方法，将某一疾病的致病基因用连锁分析的方法定位在某一染色体的特定位置上或区域内，然后在该位置上或区域内鉴定其致病基因。候选克隆：根据基因的功能、结构及已有的研究发现，预测可能与目的新基因有关的疾病，然后在相应患者中检测该基因的突变情况。基因家族—侯选疾病基因克隆策略：是利用人类基因组研究所提供的资料，根据生物进化的观点，首先在计算机上利用各种生物信息学软件和数据库完成基因的模拟克隆，然后用实验证明并克隆出该基因。遗传性多发性外生性骨疣病致病基因克隆遗传性多发性外生性骨疣患者膝关节遗传性多发性外生性骨疣患者膝关节X光检查EXT1的克隆EXT1被定位于8q24.1发现了1个染色体异常的家系缩小了EXT1的定位区间找出区间内的基因突变检测EXT2的克隆EXT1基因同源分析发现了相似序列位于Chr11文库筛选、RACE技术克隆EXT2基因在HME家系中进行突变检测发现致病突变M0309的EXT2基因的PCR检测患者M0661和M0662的EXT2基因的PCR-SSCP检测一个常染色体显性遗传

角膜环状皮样瘤家系

疾病基因的定位与克隆

角膜环状皮样瘤是一种先天性角膜良性肿瘤，呈常染色体显性遗传，以双侧眼球角膜缘处环形淡黄色肿块为特征，可延伸到结膜，患者可出现视力的改变如弱视、斜视和散光。皮样瘤由外胚层包括角化的上皮、毛发、皮脂腺和中胚层包括纤维组织、脂肪组织、血管组成中国湖南角膜环状皮样瘤家系图共有4代，57人，患者21人DNA抽提利用STR引物多重PCRGenotype基因分型Linkage连锁分析侯选基因，突变检测定位基因基因组扫描流程使用PE公司一套覆盖基因组22条常染色体、高杂合度的微卫星位点引物，一共382对。采用Touchdown程序结合多重PCR反应方法，将5-12种不同引物混合,放入同一管中进行扩增，总反应体积5μl多重PCR以上结果说明这个单体型在该家系中与疾病共分离，而这些重组事件的发生则将角膜环状皮样瘤疾病基因定位于4q24-26的D4S1572和D4S1522之间15.2cM范围内侯选基因的筛选进行UCSC数据库查询D4S1572-D4S1522之间15.2cM的基因，结果显示在这个区间总计有65个knowngenes,52个Referencegenes进行候选基因筛选时，考虑到组织发生中皮样瘤为异位到角膜的正常组织，推测角膜环状皮样瘤致病基因可能与胚层的移行、细胞的发育和分化密切相关侯选基因的筛选通过筛选，选取其中3个能与组织细胞的发育分化和移行有关并在眼睛表达的基因：CXXC4PITX2TM4SF9PITX2——是一个转录调控因子，与发育相关，有重要的功能XiaK,etal.JMedGenet(2004,41(12):e129)神经性耳聋疾病基因GJB3的克隆GJB3基因的计算机克隆

3’RACE或者nested-PCR共获得cDNA片段1059bp，其中ORF813bp，编码的氨基酸270aa。该ORF与小鼠Gjb3在813bp的一致性为83.4%，与大鼠Gjb3在813bp的一致性为84.6%。推测的氨基酸与小鼠Gjb3在270aa的一致性为82.6%，与大鼠Gjb3在270aa的一致性为83%。蛋白质的结构:4个跨膜区

2个胞外区

3个胞内区1of5Humancx31comparetootherGJBprotein2of5Humancx31comparetootherGJBprotein3of5Humancx31comparetootherGJBprotein4of5Humancx31comparetootherGJBprotein5of5Humancx31comparetootherGJBproteinGJB3(connexin31)wasmappedto1p33-35byFISH定位在1p33-35的疾病有常染色体显性遗传的感觉神经性耳聋（DFNA2）、CMT2A型的腓骨肌萎缩症、变异性红皮病和眼睑下垂。我们在中国遗传病家系收集数据库收集的神经性耳聋和腓骨肌萎缩症的病人中检测突变，在两个高频听力减退的浙江家系和湖南家系中分别发现错义和无义突变的杂合子，并选择了非相关的150名个体进行检测，未检测到错义和无义突变。KarenPSteel.NatureGenetics,20:320,1998关联研究关联指两个或多个事件之间具有统计学依赖性等位基因关联：等位基因频率随疾病性状显著增高或降低连锁不平衡：紧密连锁而产生的等位基因关联当特定标记等位基因与疾病易感基因距离很近，经过多代仍然共同传递，则人群中受累的无血缘关系的个体可能享有共同的等位基因。银屑病（Psoriasis,MIM:177900）亦称“牛皮癣”，是一种慢性炎症性皮肤病出现特征性皮损：大小不等的红斑样丘疹，表面覆盖着银白色鳞屑，可发生于身体任何部位，好发于头皮、躯干及四肢伸侧。是一种常见且严重的皮肤病。银屑病的主要临床表现银屑病在全世界的发病率约为0.6~4.8%Psoriasisoccursin0.6~4.8%oftheworld’spopulation在亚洲和美洲人的发病率在0.4%~0.7%;欧洲人中发表率略高，最高达到4.6%；据估计我国银屑病患者已接近1，000万。银屑病有2个发病高峰：

一次是在20-30岁，一次是50-60岁。银屑病的发病率银屑病的主要病理改变表皮增厚皮损和出血淋巴细胞炎性浸润银屑病的病理机制研究目前发现的主要银屑病易感基因均与免疫系统相关：主要组织相容性复合体(Themajorhistocompatibilitycomplex，MHC)组织相容性抗原(HistocompatibilityAntigens，HLA)HLA-Cw6HLA-B13,-B17,-B37,-Bw16T淋巴细胞介导(T-lymphocyte-mediatedmechanism)初筛阶段重复验证阶段合并2个阶段数据统计分析芯片平台：Illumina610k病例1139，对照1132（汉族）64个P<10-5SNPs病例5182，对照6516（汉族）提示3个可能的易感基因：MHC、IL12B、LCE发现6个关联SNP，分别位于3个基因上病例539，对照824（维吾尔族）Sequenomiplex银屑病全基因组关联分析（GWAS）研究结果样本选择10-5研究结果：一、证实了两个之前已被证实的易感位点：

MHC(rs1265181,P=1.93×10-208)

IL12B(rs3213094,Pcombined

=2.58×10-26)二、发现了一个新的银屑病易感基因位点：LCEgenecluster——on1q21(rs4085613,Pcombined=6.6910-30)通过第一阶段GWAS分析发现MHCregion与中国人群银屑病发生显著相关：

MHC区间位于chr.6:25～34Mb该研究共选择了位于该染色体区间的2,087个SNPs——左图显示了关联研究证实的：9个SNPs

7个已知基因其中红色箭头标示——rs130065位于已知银屑病易感基因PSORS1：CDSN附近；该基因

属于HLA-C基因家族。通过GWAS连锁分析发现——除MHC区域之外得到最强关联的4个SNPs均位于1q21：LCE基因家族（rs4112788,rs4845454,rs4085613,rs1886734）。左图显示了LCE基因家族区域附近的基因和LD连锁图：—上图显示所有位于区间内的基因—中图和下图分别显示了根据中国人和欧洲人基因频率绘制的LD连锁图左图黄色箭头显示rs6701216位点，该SNP被其他研究重复与银屑病相关。LCE基因家族与银屑病♣LCE家族编码：角质包膜蛋白——在表皮终末分化过程发挥了重要作用。

该研究假设由于LCE易感基因变异导致表皮角质包膜异常、角质细胞的分化异常，从而影响银屑病发生。Follow–UPStudyofPsoriasisGWAS银屑病二期GWAS研究♣第二阶段GWAS研究使用的样本中国人：8312患者+12919对照；高加索人：3293患者+4188对照+254核心家系发现6个新的银屑病易感位点参加的国家：美国、中国、瑞典、新加坡银屑病GWAS后续研究策略——更大规模（不同人种）样本验证生物信息学分析鉴定潜在的致病Alleles多层次的功能学验证分子水平、细胞水平、动物模型...揭示银屑病的分子致病机制通过GWAS研究提示与疾病关联的SNPs...Millersyndrome米勒综合症(Millersyndrome)(MIM#263750)导致患者口、眼、耳、足等畸形的遗传病严重小颌症唇腭裂四肢末端发育不良或不发育眼睑缺损多乳头连锁分析遗传病家系已知基因筛选新一代测序共分离研究克隆致病基因验证LargefamilySmallfamilyNoYescandidateSeqknowngene(s)新一代测序（NextGenerationSequencing）84BackgroundDNAGenomicDNAFragment

&addlinkersHybridizeNimbleGenArrayWashEluteSequencingProbesTargetDNATargetDNAExon1Exon2Exon3Exon4Exon5Exon6AmplificationDenaturationwithNaOHbeforeaddingtoFCInitialextensionwithTaqPolymeraseDenaturationwithformamideSubsequentamplificationwithBstpolymerase35cyclesat60oC5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’CAGTCATCACCTAGCGTA FirstbaseincorporatedCycle1: Addsequencingreagents Removeunincorporatedbases DetectsignalCycle2-n:AddsequencingreagentsandrepeatAllfourlabelednucleotidesinonereactionHighaccuracyBase-by-basesequencingNoproblemswithhomopolymerrepeatsSequencingBySynthesis(SBS)TTTTTTT

G

T…T

G

C

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A

C

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T…Theidentityofeachbaseofaclusterisreadofffromsequentialimages.123789456样本选择

3个多发家系，家系间无亲缘关系，父母表型正常，均有两个患病的后代正常对照为8个Hapmap个体3个家系之间没有亲缘关系研究方法与结果方法

3个家系的4个受累个体（家系1-A，家系1-B，家系2，家系3）外显子组测序。结果获得数据平均5.1Gb/人，捕获的26.6Mb外显子区域其覆盖率达到40倍，覆盖了该区域97%的序列

如何过滤和筛选数据？两个模型Dominantmodel

至少应有1个位于同一基因的NS/SS/I突变，且覆盖率应为40倍以上Recessivemodel至少应有2个位于同一基因的NS/SS/I突变且覆盖率应>500倍

无义突变（NS）剪接位点突变（SS）插入/缺失(indels;I)过滤和筛选数据家系1中1-A，1-B中过滤掉dbSNP和HapMap中的常见的突变

Dominantmodel：228Recessivemodel：9家系1与家系2和3（均过滤dbSNP和HapMap）比较

Dominantmodel：26Recessivemodel：onlyasinglegene,DHODH

过滤和筛选数据NS/SS/I突变是否有危害Recessivemodel中DHODH并未入选Dominantmodel中DHODH

在家系1中发现G605A（与疾病无关），但G454A可能与疾病相关。但每个个体DHODH

的新发突变均为复合杂合子，且6个突变中的5个可能与疾病相关，因此仍考虑该疾病为Recessivemodel。过滤和筛选数据---结果SarahBNgetal.Sanger测序验证候选基因的突变

方法

筛查另外3个没有亲缘关系的该疾病家系的病人及家系2中的另一个患病个体的DHODH，及正常对照200人。结果