生物化学教案【蛋白质】-课件

蛋白质

蛋白质-英文为“Protein”——第一重要.

功能蛋白,大多为球状；细胞膜—载体蛋白（物质、信号）、酶细胞质(包括细胞器)—酶（物质代谢）、信号传递细胞核—酶（遗传）、结构蛋白（染色体骨架）细胞质(包括细胞器)—酶（物质代谢）、信号传递蛋白质分布广泛、功能多样1.催化功能-酶2.结构功能-皮、毛、骨、牙、

细胞骨架3.载运功能-膜蛋白4.调控功能-激素5.运动功能-鞭毛、肌肉蛋白6.防御功能-免疫球蛋白7.神经传导基本功能辅助功能第四章

蛋白质化学第一节

蛋白质的分子组成第二节蛋白质分子的结构第三节蛋白质的理化性质第四节氨基酸、蛋白质的分离与鉴定蛋白质化学1(分类）

蛋白质功能

形状球蛋白：球形、易溶解。组成溶解性

纤维蛋白：形似纤维、不溶于水。单纯蛋白：只有α－氨基酸，多数蛋白。清蛋白（白蛋白）：溶于水。球蛋白：微溶于水，溶于稀盐。醇蛋白：不溶于水，溶于乙醇。缀合蛋白：与非蛋白质物质结合，如核、糖、脂蛋白。活性蛋白：如酶、激素，受体、膜蛋白。非活性蛋白：胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白。一、蛋白质的元素组成二、组成蛋白质分子的基本单位—氨基酸三、肽键与肽第一节蛋白质的分子组成多数蛋白质含:

碳(C)50～56%氢(H)6～8%

氧(O)19～24%氮(N)13～19%

硫(S)0～4%有些蛋白质含有磷少数含铁、铜、锰、锌、钴、钼等个别还含有碘一、蛋白质的元素组成1凯氏(Kjedahl)定氮法一、蛋白质的元素组成2蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。含氮量*6.25=蛋白含量

每克样品含氮的克数×6.25×100

=100克样品中蛋白质的含量(克%)（三）蛋白质的水解（一）氨基酸的分类（二）不常见的氨基酸（四）氨基酸的一般理化性质二、氨基酸（五）氨基酸的化学反应

氨基酸是含有氨基的酸CHRCOO－H3N+(甘油醛的D型、L型)D-甘油醛L-甘油醛透视式投影式氨基酸的构型L－氨基酸D－氨基酸（二）氨基酸的分类1（三种分类法）1．根据其化学结构分为：

（1）脂肪族氨基酸（2）芳香族氨基酸（3）杂环氨基酸2．根据酸碱性质

（1）酸性氨基酸（2）碱性氨基酸（3）中性氨基酸3．根据R基团的极性

（1）非极性R基氨基酸（2）极性R基氨基酸（不带电荷的、带正电荷的、带负电荷的）（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸1一氨基一羧基氨基酸1普通名称化学名英文名代号代号甘氨酸氨基乙酸GlycineGly(G)甘（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸2一氨基一羧基氨基酸2普通名称化学名英文名代号代号丙氨酸-氨基丙酸AlanineAla(A)丙（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸3一氨基一羧基氨基酸3普通名称化学名英文名代号代号缬氨酸-氨基异戊酸ValineVal(V)缬（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸4一氨基一羧基氨基酸4普通名称化学名英文名代号代号亮氨酸-氨基异己酸LeucineLeu(L)亮（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸5一氨基一羧基氨基酸5普通名称化学名英文名代号代号异亮氨酸-氨基--甲基戊酸IleucineIle(I)异亮（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸6一氨基二羧基氨基酸1普通名称化学名英文名代号代号天冬氨酸-氨基丁二酸AspartateAsp(D)天（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸7一氨基二羧基氨基酸2普通名称化学名英文名代号代号谷氨酸-氨基戊二酸GlutamateGlu(E)谷（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸7含酰胺基氨基酸1普通名称化学名英文名代号代号天冬酰胺AsparagineAsn(N)（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸9含酰胺基氨基酸2普通名称化学名英文名代号代号谷氨酰胺GlutamineGln(Q)（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸10二氨基一羧基氨基酸1普通名称化学名英文名代号代号精氨酸-氨基--胍基戊酸ArginineArg(R)精（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸11二氨基一羧基氨基酸2普通名称化学名英文名代号代号鸟氨酸-二氨基戊酸OrnithineOrn鸟（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸12二氨基一羧基氨基酸3普通名称化学名英文名代号代号赖氨酸，-二氨基己酸LysineLys(K)赖（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸13羟基氨基酸1普通名称化学名英文名代号代号丝氨酸-氨基--羟基丙酸SerineSer(S)丝

（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸14羟基氨基酸2普通名称化学名英文名代号代号苏氨酸-氨基--羟基丁酸ThreonineThr(T)苏（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸15含巯基氨基酸1普通名称化学名英文名代号代号半胱氨酸-氨基--巯基丙酸CysteineCys(C)半胱（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸16含巯基氨基酸2普通名称化学名英文名代号代号胱氨酸二(-氨基--巯基丙酸)CysteineCys-Cys胱（二）氨基酸的分类1（据化学结构1）脂肪族氨基酸17含硫基氨基酸3普通名称化学名英文名代号代号甲硫氨酸(蛋氨酸)-氨基--甲硫基丁酸MethionineMet(M)甲硫（二）氨基酸的分类1（据化学结构2）芳香族氨基酸1普通名称化学名英文名代号代号苯丙氨酸-氨基--苯基丙酸PhenylalaninePhe(F)苯丙（二）氨基酸的分类1（据化学结构2）芳香族氨基酸2普通名称化学名英文名代号代号酪氨酸-氨基--对羟苯基丙酸TyrosineTyr(Y)酪（二）氨基酸的分类1（据化学结构3）杂环氨基酸1普通名称化学名英文名代号代号组氨酸-氨基--咪唑基丙酸HistidineHis(H)组（二）氨基酸的分类1（据化学结构3）杂环氨基酸2普通名称化学名英文名代号代号色氨酸-氨基--吲哚基丙酸TryptophanTrp(W)色（二）氨基酸的分类1（据化学结构3）杂环氨基酸3普通名称化学名英文名代号代号脯氨酸四氢吡咯-2-羧酸ProlinePro(P)脯亚氨基酸（二）氨基酸的分类1（据化学结构3）杂环氨基酸4普通名称化学名英文名代号代号羟脯氨酸4-羟基吡咯烷-2-羧酸HydroxprolineHyp羟（二）氨基酸的分类2（据酸碱性质）酸性氨基酸天冬氨酸谷氨酸（二）氨基酸的分类2（据酸碱性质）碱性氨基酸赖氨酸精氨酸组氨酸（二）氨基酸的分类2（据酸碱性质）中性氨基酸

含一氨基一羧基的氨基酸，包括两种酸性氨基酸产生的酰胺（谷氨酰胺和天冬酰胺）。（二）氨基酸的分类3（据R基因极性）非极性氨基酸1苯丙氨酸胱氨酸蛋氨酸甘氨酸丙氨酸缬氨酸亮氨酸异亮氨酸脯氨酸色氨酸（二）氨基酸的分类3（据R基团极性）非极性氨基酸2

甘氨酸按理属于极性的，但因其α-碳上的氢受到易解离的α-氨基和α-羧基的影响，因此不体现极性。（二）氨基酸的分类3（据R基团极性）极性氨基酸1不带电荷的酪氨酸半胱氨酸丝氨酸苏氨酸天冬酰胺谷氨酰胺（二）氨基酸的分类3（据R基团极性）极性氨基酸2带正电荷的(碱性氨基酸)赖氨酸精氨酸组氨酸（二）氨基酸的分类3（据R基团极性）极性氨基酸3带负电荷的(酸性氨基酸)天冬氨酸谷氨酸（三）不常见的氨基酸-丙氨酸-氨基丁酸H2N-CH2-CH2-COOHH2N-CH2-CH2-CH2-COOH1．酸水解2．碱水解3．酶水解（三）蛋白质的水解（三）蛋白质的水解1（酸水解）

常用方法：硫酸或盐酸处理浓度:盐酸为6mol/L

硫酸为4mol/L

条件:回流煮沸20小时左右优点:不引起消旋作用，得到L-氨基酸缺点:色氨酸完全被沸酸所破坏羟基氨基酸（丝,苏）部分被水解天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。（三）蛋白质的水解1（碱水解）常用方法：用氢氧化钠处理浓度:5mol/L条件:共煮10~20h优点:色氨酸稳定缺点:多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋现象；所得为D型和

L型混合氨基酸；碱水解引起精氨酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素。（三）蛋白质的水解1（酶水解1）优点:不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。缺点:需要几种酶协同作用，酶水解所需时间较长。

（三）蛋白质的水解1（酶水解2）（牛胰蛋白酶）胰蛋白酶1（三）蛋白质的水解1（酶水解2）NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点R1：赖氨酸（Lys）精氨酸（Arg）特点：专一性较强，水解速度快胰蛋白酶2（三）蛋白质的水解1（酶水解3）糜蛋白酶1（三）蛋白质的水解1（酶水解3）糜蛋白酶2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点R1：苯丙氨酸(Phe)色氨酸（Trp）苏氨酸(Thr)亮氨酸(Leu)特点：水解稍慢（三）蛋白质的水解1（酶水解4）胃蛋白酶1（三）蛋白质的水解1（酶水解4）胃蛋白酶2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点R1、R2：苯丙氨酸(Phe)色氨酸（Trp）苏氨酸(Thr)亮氨酸(Leu)特点：水解速度较快（四）氨基酸的一般理化性质1物理性质物理性状：无色结晶物。熔点：熔点高，一般在200℃以上。溶解性：通常能溶于极性溶剂,而不溶于非极性溶剂;各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中。旋光性：风味：（四）氨基酸的一般理化性质2两性解离和等电点1

氨基酸在溶液中主要以兼性离子形式存在CHRCOO－H3N+（四）氨基酸的一般理化性质2两性解离和等电点2加酸时CHRCOOHH3N+H+H+总电荷“+”（四）氨基酸的一般理化性质2两性解离和等电点3加碱时CHRCOO-H2N总电荷“－”OH－OH－（四）氨基酸的一般理化性质2两性解离和等电点5等电点（pI）：当溶液为某一pH值，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等时(净电荷为0),这一pH值即为氨基酸的等电点。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。（四）氨基酸的一般理化性质2两性解离和等电点4COO－CHH3N+R+OH－+H+COO－CHH2NR+OH－+H+在酸性溶液中（pH＜pI）在晶体状态或水溶液中（pH=pI）在碱性溶液中（pH＞pI）（四）氨基酸的一般理化性质2两性解离和等电点7丙氨酸pI的计算COO－CH+H+H3N+CH3K1COOHCHH3N+CH3COO－CHH2NCH3K2Ala+Ala±Ala－K1=[Ala±][H+]/[Ala+][Ala+]=[Ala±][H+]/K1K2=[Ala－][H+]/[Ala±][Ala－]=[Ala±]K2/[H+]到达等电点时，[Ala+]=[Ala－]∴[Ala±][H+]/K1=[Ala±]K2/[H+]，即：K1K2=[H+]2两边取负对数：－lg[H+]2=－lgK1－lgK2∵－lg[H+]

=pH－lgK1=pK1－

lgK1=pK2∴2pH=pK1＋pK2令pI为等电点时的pH，则：pI＝（pK1＋pK2）/2（四）氨基酸的一般理化性质2两性解离和等电点8天冬氨酸pI的计算Asp+Asp±Asp－COOHCHH3N+CH2COOHCOO－CHH3N+CH2COOHCOO－CHH3NCH2COK1KRK2Asp=COO－CHH2NCH2COO－等电点时为Asp±∴pI＝（pK1＋pKR）/2O－+（四）氨基酸的一般理化性质2两性解离和等电点9赖氨酸pI的计算Lys++Lys+Lys±COOHCHH3N+(CH2)4NH3+COO－CHH3N+(CH2)4NH3+COO－CHH2N(CH2)4NH3+K1K2KRLys－COO－CHH2NCH2NH2等电点时为Lys±∴pI＝（pK2＋pKR）/2（四）氨基酸的一般理化性质2两性解离和等电点6侧链不含解离基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK’1和pK’2的算术平均值：pI=(pK’1+pK’2)/2同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK’值的算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’R)/2碱性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R)/2

（四）氨基酸的一般理化性质3芳香族氨基酸的紫外吸收光谱1构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝275nm苯丙氨酸的max＝257nm色氨酸的max＝280nm（四）氨基酸的一般理化性质3芳香族氨基酸的紫外吸收光谱2（五）氨基酸的化学反应α-氨基参加的反应：亚硝酸反应、2，4-二硝基氟苯反应等。α-羧基参加的反应：叠氮、脱羧、成盐、成酯反应。α-氨基和α-羧基共同参加的反应：茚三酮反应及成肽反应。侧链参与的反应：（五）氨基酸的化学反应1α│氨基参加的反应1与亚硝酸反应原理：自由氨基能与亚硝酸反应释放出氮气，每克分子的自由氨基可生成一克分子氮气。在生产上常用此法来测定蛋白质的水解程度。RCHCOOHNH2+HNO2RCHCOOHOH+N2↑+H2O（五）氨基酸的化学反应2α│氨基参加的反应2

AADNFB+多肽蛋白+HF

DNP-AADNP-多肽

DNP-蛋白原理：在弱碱性溶液中，氨基酸的α-氨基很容易与DNFB作用，生成稳定的黄色DNP-氨基酸（2，4一二硝基苯氨基酸）,多肽或蛋白质N-末端氨基酸的α-氨基也能与DNFB反应用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸,亦称Sanger反应。2，4一二硝基氟苯反应1（五）氨基酸的化学反应2α│氨基参加的反应22，4一二硝基氟苯反应2RCHNH2+HF+NO2FNO2COOHRCHNCOOHHpH8~9NO2NO2DNP-氨基酸（五）氨基酸的化学反应2α│氨基参加的反应22，4一二硝基氟苯反应35—二甲氨基萘磺酰氯（丹磺酰氯）可以来代替DNFB。因为它具有强烈的荧光，可用荧光光度计快速检出，灵敏度高。O=S=OClCH3NCH3（五）氨基酸的化学反应2α│氨基参加的反应2丹磺酰氯反应（五）氨基酸的化学反应2α│氨基参加的反应3异硫氰酸苯脂反应1用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸,亦称Edman反应。弱碱AAPITC+多肽蛋白AAPTC—多肽蛋白HFPTH-AA+少一个AA的多肽或蛋白异硫氰酸苯酯苯氨基硫甲酰--苯硫乙酰脲（五）氨基酸的化学反应2α│氨基参加的反应3异硫氰酸苯脂反应2NH2CHCOR2NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNCOCHNHSCR1PTH-氨基酸PTC-氨基酸HFpH8.3（五）氨基酸的化学反应3α│氨基参加的反应1甲醛反应RCHNH3+HCHORCHNHCH2OHHCHORCHN(CH2OH)2羟甲基氨基酸二羟甲基氨基酸用途：进行氨基酸的酸碱滴定COO－COO－COO－（五）氨基酸的化学反应3α│羧基参加的反应叠氮反应YNHCHCOOHRNH2NH2+2H2OYNHCHCONHNHRHNO2YNHCHCON3R用途：可活化羧基，常用于人工合成肽过程。酰化氨基酸酰化氨基酸的肼衍生物酰化氨基酸叠氮（五）氨基酸的化学反应4α-氨基与α-羧基共同参加的反应1茚三酮水合茚三酮茚三酮反应1（五）氨基酸的化学反应4α-氨基与α-羧基共同参加的反应1用途：常用于氨基酸的定性或定量分析茚三酮反应2还原茚三酮茚三酮蓝紫色物质（五）氨基酸的化学反应4α-氨基与α-羧基共同参加的反应1茚三酮反应3脯氨酸及羟脯氨酸与茚三酮反应产物N+黄色化合物（五）氨基酸的化学反应4α-氨基与α-羧基共同参加的反应2成肽反应用途：是多肽和蛋白质生物合成的基本反应构成蛋白质的氨基酸有

种，一般可根据氨基酸侧链（R）的

大小分为

侧链氨基酸和

侧链氨基酸两大类。其中前一类氨基酸侧链基团的共同特怔是具有

性；而后一类氨基酸侧链（或基团）共有的特征是具有

性。碱性氨基酸（pH6～7时荷正电）有两种，它们分别是

氨基酸和

氨基酸；酸性氨基酸也有两种，分别是

氨基酸和

氨基酸。紫外吸收法（280nm）定量测定蛋白质时其主要依据是因为大多数可溶性蛋白质分子中含有

氨基酸、

氨基酸或

氨基酸。氨基酸与水合印三酮反应的基团是

，除脯氨酸以外反应产物的颜色是

；因为脯氨酸是—亚氨基酸，它与水合印三酮的反应则显示

色。精氨酸的Pk1=2.17、Pk2=9.04（-NH3）Pk3=12.48（胍基）PI=（

）A、1/2(2.17+9.04)B、1/2(2.17+12.48)C、1/2(9.04+12.48)D、1/3（2.17+9.04+12.48）谷氨酸的Pk1=2.19(-COOH)、pk2=9.67(-NH3)、pk3=4.25(-COOH)pI=（

）A、1/2（2.19+9.67）

B、1/2（9.67+4.25）C、1/2(2.19+4.25)D、1/3(2.17+9.04+9.67)pH为8时，荷正电的氨基酸为（

）A、GluB、LysC、SerD、Asn氨基酸与亚硝酸反应所释放的N2气中，氨基酸的贡献是（

）A、25%B、50%C、80%D、100%三、肽键与肽1CH3CHNH2COOH+CH2OHCHNH2COOHH2OCH3CHNH2COCH2OHCHNHCOOH(酰胺键)－N端－C端CNOH肽键三、肽键与肽2肽键

肽键就是由氨基酸的α-羧基与相邻的氨基酸的α-氨基脱水缩合起来的键。三、肽键与肽3肽肽:氨基酸通过肽键连结起来的化合物。二肽:两个氨基酸形成的肽。三肽:三个氨基酸形成的肽。多肽:许多氨基酸形成的肽。蛋白质:多是组成氨基酸超过50个的多肽。氨基酸残基:氨基酸由于形成肽键而失去了一分子水，因此表现出其分子的不完整。末端氨基和末端羧基：缩合后的氨基酸，只在肽的两端有自由的α-氨基和α-羧基，简称N-端和C-端。三、肽键与肽4肽链的命名肽链的命名：根据组成的氨基酸残基来确定。规定从肽链的N-端残基开始，依次称为某氨基酰、氨基酰……某氨基酸。如：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸NH2SerGlyTryAlaLeuCOOHNH2

SerGlyTryAlaLeuCOOH肽键：

肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。酰胺平面

多肽链的立体结构三、肽键与肽5二硫键1二硫键：是由二个半胱氨酸残基的侧链之间形成的。即胱氨酸的残基中的二硫键。二硫键类型：可以使两条单独的肽链共价交联起来（链间二硫键）；也可以使一条链的某一部分形成环（链内二硫键）。三、肽键与肽5二硫键2半胱氨酸H2半胱氨酸三、肽键与肽5二硫键3链间二硫键NHCHCONHCHCONHCHCOR1R2CH2SSCH2NHCHCONHCHCONHCHCOR3R4二硫键HSCH2CHCOO－NH3+半胱氨酸三、肽键与肽5二硫键2链内二硫键第二节蛋白质分子的结构一、蛋白质分子的一级结构

二、蛋白质的三维构象一、蛋白质分子的一级结构1☆蛋白质的一级结构，又称为化学结构，是指氨基酸在肽链中的排列顺序及二硫键的位置，是多肽链具有共价键的主链结构。最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。蛋白质是由数条多肽链组成。一级结构(Primarystructure)的含义一、蛋白质分子的一级结构2一、蛋白质分子的一级结构3牛胰岛素的一级结构1一、蛋白质分子的一级结构3

我国1965年在世界上第一个用化学方法人工合成的蛋白质就是这种牛胰岛素。胰牛胰岛素的一级结构2二、蛋白质的三维构象1(目录）(一)蛋白质分子的二级结构(二)蛋白质的三级结构

(三)蛋白质分子的四级结构二、蛋白质的三维构象2(定义）

蛋白质分子的三维构象也称空间结构或高级结构。指的是蛋白质分子中原子基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向。

二、蛋白质的三维构象3(示例1蛋白酶抑制剂）二、蛋白质的三维构象3(示例3木瓜及组织蛋白酶）二、蛋白质的三维构象3(示例5）（二）蛋白质分子的二级结构1定义：主链上原子的局部空间排列而形成的折叠、盘曲构象，不涉及侧链构象。类型：天然蛋白质一般均含有α-螺旋、β-折叠和β-转角、无规则卷曲的结构。

（二）蛋白质分子的二级结构2维持蛋白质分子构象的化学键3（5）二硫键（二硫桥）：两个硫原子之间形成的共价键。此键作用很强，可把不同肽链或同一条肽链的不同部分连在一起，对稳定蛋白质构象起重要作用。大多数蛋白质分子由于二硫键的断裂其生物学活性随即丧失。维持蛋白质构象的化学键主要是次级键（氢键、离子键、疏水作用和范德华力）。这些次级键是非共价键。肽键、二硫键、酯键等被称之为共价键。（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型1（1）-螺旋最常见的二级结构形式。（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型1（1）-螺旋特点1①每隔3.6个氨基酸残基，螺旋上升一圈。上升一圈相当于向上平移0.54nm，即每个氨基酸残基上升0.15nm，每个残基沿轴旋转1000。（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型1（1）-螺旋特点2②氨基酸残基侧链伸向外侧，相邻螺圈之间形成链内氢键。氢键是由每个氨基酸残基的N-H与前面隔三个氨基酸残基的C=0形成的。（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型1（1）-螺旋特点3③一般为右手螺旋。（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型1（1）-螺旋特点4④链中如有脯氨酸，则螺旋被中断，产生一个“结节”，这是因为脯氨酸的亚氨基上的氢参与肽键形成后没有多余的氢原子形成氢键，这样肽链拐弯不再形成α-螺旋。脯氨酸（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型1（1）-螺旋特点5⑤另外，甘氨酸由于没有侧链的约束，难以形成α-螺旋所需的二面角。其次，如肽链中连续存在带相同电荷的氨基酸，由于同性电荷相斥也会影响α-螺旋不稳定。甘氨酸（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型1（1）-螺旋（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型2（2）β-折叠结构

当将α-螺旋用热水和稀碱等方法处理或用力拉直，此时α-螺旋被伸展，氢键被破坏，而形成β-折叠。

（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型2（2）β-折叠结构特点1-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型2（2）β-折叠结构特点2在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm。（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型2（2）β-折叠结构特点3

-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型2（2）β-折叠结构特点4

平行式反平行式所有肽链的N-端都在同一边相邻两条肽链的方向相反（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型2（2）β-折叠结构

侧面观（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型3（3）β-转角结构1这类结构主要存在于球状蛋白分子中。-转角部分，由四个氨基酸残基组成弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O

和第四个残基的–N-H之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型3（3）β-转角结构2

β-转角（二）蛋白质分子的二级结构2二级结构的类型3

α螺旋β折叠片β转角自由回转超二级结构

在蛋白质中，特别是球状蛋白质中，经常可以看到由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体充当三级结构的构件，称为超二级结构。已知的超二级结构有三种基本组合形式：（αα），（βαβ）和（βββ）。

结构域是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球行的结构，具有部分生物功能。

在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成二个或多个在空间上可以明显区别它与蛋白质亚基结构的区别。一般每个结构域约由100-200个氨基酸残基组成，各有独特的空间构象，并承担不同的生物学功能。（三）蛋白质的三级结构1

定义：蛋白质的三级结构(TertiaryStructure)是具有二级结构、超二级结构或结构域的多肽链，由于其序列上相隔较远的氨基酸残基侧链的相互作用，而进行范围广泛的盘曲和折叠，形成包括主、侧链在内的空间排列，这种在一条多肽链中所有原子的三维空间的整体排布成为三级结构。维系力：主要有氢键、疏水键、离子键、范德华力和二硫键等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。维持蛋白质分子构象的化学键1（1）氢键：一个氢原子连接两个电负性强的原子（如氧、氮等）。其中一个为共价键，另一个即为氢键。在α-螺旋和β-折叠中占有极重要的地位，对蛋白质分子三维构象的维护也很重要。（2）静电引力：正负带电基团之间的吸引力，如NH3+与COO-。静电引力较强，但对蛋白质分子三维构象的稳定贡献不是很大，有时也称为离子键或盐键。维持蛋白质分子构象的化学键2（3）范德华力：是分子间的吸引力，是原子团相互接近时诱导产生的。它变化多样，对维持蛋白质活性中心的构象影响很大。（4）疏水相互作用：是非极性基团为了避开水相而群集在一起的作用力。疏水作用是维持蛋白质高级结构的重要因素。（三）蛋白质的三级结构3维持三级结构的作用力1（三）蛋白质的三级结构3维持三级结构的作用力2无三级结构形成三级结构（三）蛋白质的三级结构3维持三级结构的作用力3

肽键

二硫键离子键

氢键疏水键

范德华力

90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol这四种键能远小于共价键，称次级键。次级键微弱但却是维持蛋白质三级结构中主要的作用力,原因是因为其数量巨大。（三）蛋白质的三级结构4

（三）蛋白质的三级结构5

肌红蛋白的三级结构（四）蛋白质分子的四级结构1

很多蛋白质分子是由两个或两个以上独立的、具有三级结构的多肽链组成的。这些多肽链之间并没有共价键的联系，只是借次级键缔合在一起，这就形成了四级结构。蛋白质的四级结构：蛋白质分子中，各个亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用。在四级结构的蛋白质分子中，每个具有三级结构的多肽链单位称为亚基，亚基多无生物学活性，具有完整四级结构的蛋白质分子才有生物活性。（四）蛋白质分子的四级结构2

（四）蛋白质分子的四级结构3

血红蛋白中四亚基两两相同，分别称为α1、α2、β1、β2血红细胞（四）蛋白质分子的四级结构4血红蛋白中的二聚体之一α2与β2第三节蛋白质的理化性质一、蛋白质的分子量二、两性解离和等电点三、蛋白质的胶体性质四、蛋白质的沉淀反应五、蛋白质的变性和复性六、蛋白质的颜色反应一、蛋白质的分子量蛋白质的分子量一般在1万—100万道尔顿（相对分子质量）由于是生物大分子，因此在溶液中极不稳定，不能用测定小分子物质的方法（如冰点降低、沸点升高）来测定一般以渗透压法、凝胶过滤、聚丙烯酰胺凝胶电泳及超离心法来测定其分子量。超离心法较准确，但实验条件要求很高二、两性解离和等电点1+OH－+H++OH－+H+COOHPrH3N+COO－PrH3N+COO－PrH2NpH＜pI4＜7pH=pI7=7pH＞pI9＞7

由于蛋白质是由氨基酸组成，氨基酸所具有的两性解离性质，蛋白质也同样具有二、两性解离和等电点2肽与氨基酸都有α－COOH，α－NH2，但肽还含有侧链R基上的可解离基团，且其为主要解离基团。蛋白质的等电点：在某一pH值时，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即静电荷为零，这时溶液的pH为该蛋白的等电点。蛋白质的等电点由其所含的氨基酸的种类和数量决定。蛋白质在其等电点时，溶解度最小。原因是等电点时，静电荷为零，溶液中没有相同电荷的互相排斥作用，蛋白质分子由于静电引力迅速结合成较大的聚集体而沉淀出来。蛋白质两性解离的特点二、两性解离和等电点3在同一pH溶液中，由于各种蛋白质所带电荷的性质和数量以及分子大小不同，因此它们在电场中的移动速度也有差别，可以利用这种性质来分离和分析蛋白质，称为蛋白质电泳分析法。常用的有纸上电泳、醋酸纤维膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质两性解离的应用1二、两性解离和等电点3蛋白质两性游离的应用2电泳三、蛋白质的胶体性质1

由于蛋白质分子大，且球状蛋白质分子中亲水的氨基酸残基多位于颗粒表面，故在水溶液中能与水起水合作用。因此，蛋白质的水溶液具有亲水胶体的性质为什么蛋白质具有胶体性质三、蛋白质的胶体性质2蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有二个稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。若无外力条件作用，不致互相凝集。蛋白质胶体稳定的原因三、蛋白质的胶体性质3蛋白质具有许多高分子溶液的性质。如扩散、粘度大、不能透过半透膜。利用不能透过半透膜的性质可以将蛋白质和其他一些小分子分开，常用方法有透析和超滤。三、蛋白质的胶体性质4透析血液透析小分子溶出小分子被带出透析机透析液血液加压三、蛋白质的胶体性质4超滤四、蛋白质的沉淀反应1(概述)蛋白质的沉淀:当溶液中的蛋白质分子的水化膜被破坏或电荷被中和后，使蛋白质从溶液中析出的现象。原理:蛋白质稳定因素有水化层和带电层,水化层是蛋白质分子表面的许多亲水基团与水分子结合形成的一层水膜，它使蛋白质颗粒不能相互接触聚集成大颗粒；带电层是蛋白质分子表面的可解离基团在一定pH环境下解离产生的。由于带同性电荷的蛋白质颗粒相互排斥，也使蛋白质颗粒不能聚集，当改变这些稳定因素，蛋白质分子相聚集而从溶液中析出。

。四、蛋白质的沉淀反应2(方式1)定义:加入大量中性盐(硫酸铵)以破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质从水溶液沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质的等电点(溶解度最小，易沉淀)则效果最好。各种蛋白质分子的颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。因此，调节混合蛋白质的溶液中的中性盐的浓度，可使各种蛋白质分段沉淀。1．盐析1（高浓度盐类）四、蛋白质的沉淀反应2(方式1)1．盐析2为什么加入硫酸铵会引起蛋白质的盐析？当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。四、蛋白质的沉淀反应2(方式2)pH稍大于等电点为宜，因为此时蛋白质带负电，易与金属离子结合成盐。通常这种沉淀为变性的，如控制温度（低温）并控制重金属离子浓度，则可用于分离制备不变性的蛋白质。

2．重金属盐沉淀蛋白质四、蛋白质的沉淀反应2(方式3)某些生物碱试剂（如苦味酸、钨酸、鞣酸、碘化钾等）及某些酸（三氯乙酸、水杨磺酸、硝酸等）与蛋白质结合成不溶性的盐沉淀。沉淀条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电，易与酸根负离子结合成盐。3．生物碱试剂与某些酸类沉淀蛋白质四、蛋白质的沉淀反应2(方式4)可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。如酒精的消毒作用。在低温条件下，变性进行较缓慢，可以用来制备蛋白质。其优点在于：不像盐析那样存在有大量盐类，必须经透析除去，而且有机溶剂很易通过稀释透析及蒸发等方法除去。4．有机溶剂沉淀蛋白质四、蛋白质的沉淀反应2(方式5)将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热可使蛋白质发生凝固而沉下。鸡蛋煮熟后，本来流动的蛋清、蛋黄都变成固体样的东西了。这是蛋白质凝固作用应用于食品加工的典型例子。5．加热凝固五、蛋白质的变性和复性（变性1）定义:以某些物理或化学因素的作用，使蛋白质严格的空间构象被破坏（不包括肽键的断裂），而引起蛋白质若干理化和生物学性质的改变。影响蛋白质变性的因素:紫外线照射、加热煮沸、强酸、强碱、重金属盐和有机溶剂处理等。原理:维持蛋白质二级、三级和四级结构的严格构象的力只是一些弱的次级键，它们很容易被破坏。特点:天然构象被破坏，蛋白质失去了生物学活性。五、蛋白质的变性和复性（变性2）五、蛋白质的变性和复性（变性3）五、蛋白质的变性和复性（复性）复性:某些变性蛋白质，再除去变性因素后，可以重新获得其天然结构和生物活性，称为蛋白质的“复性”。如有一些球蛋白被热或极端pH变性后，若缓慢冷却或缓慢恢复到正常pH时，将重新获得其天然结构和生物活性。这种复性现象，即蛋白质折叠研究中的所谓“折叠”。六、蛋白质的颜色反应11.双缩脲反应1原理:蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色混合物。应用:可以用此反应来定性测定蛋白质；也可在540nm处比色，定量测定蛋白质。六、蛋白质的颜色反应12H2N－C－NH2H2N－C－N－C－NH2＋NH3↑1800COOHO尿素双缩脲双缩脲CuSO4+NaOH紫红色物质1.双缩脲反应2六、蛋白质的颜色反应22.酚试剂（福林-酚试剂）反应原理:蛋白质分子一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物）应用:常用此反应来定量测定蛋白质含量。（考马思亮兰G-250法）六、蛋白质的颜色反应3含有芳香族氨基酸，特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。蛋白质溶液遇硝酸后先产生白色沉淀，加盐则白色沉淀变成黄色，再加碱呈橙黄色。因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物3．蛋白质的黄色反应1六、蛋白质的颜色反应33．蛋白质的黄色反应2

硝基酚（黄色）

邻硝醌酸钠（橙黄色）六、蛋白质的颜色反应44．米伦反应米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液。当蛋白溶液中加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。由于酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故有此反应。六、蛋白质的颜色反应5．乙醛酸反应1在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环。凡含有吲哚基的化合物都有此反应，由于色氨酸含有类似结构，因此含有色氨酸或含色氨酸的蛋白质都有此反应。六、蛋白质的颜色反应5．乙醛酸反应2六、蛋白质的颜色反应66．坂口反应1原理:精氨酸分子中的胍基，能与次氯酸钠、或次溴酸钠及α－萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物。应用:此反应可以用来鉴定含有精氨酸的蛋白质，也可用来测定精氨酸的含量。六、蛋白质的颜色反应66．坂口反应2红色六、蛋白质的颜色反应66．坂口反应3第四节氨基酸及蛋白质分离提纯1无论是对蛋白质结构与功能的研究，或是生产人们所需要的蛋白质产品，都涉及蛋白质的分离纯化。目前对蛋白质的制备，主要是从生物组织中提取分离。一般的程序为：

前处理：组织、细胞破碎等。

粗分级：盐析、沉淀等。

细分级：层析、电泳等。第四节氨基酸及蛋白质分离提纯2一、氨基酸的分析分离

二、蛋白质混合物的分离方法

三、蛋白质的鉴定

一、氨基酸的分析分离1类型：分配层析法(包括柱层析、纸层析和薄层层析)基本原理：所有的层析系统通常都由两个相组成，一个为固定相的或静相；一个为流动相或动相。一、氨基酸的分析分离2分配系数Kd

：混合物在层析系统中的分离，决定于该混合物的组分在两相中的分配情况，即分配系数：

Kd=CA/CBCA，CB分别代表某一物质在互不相溶的两相A，B中的浓度。一、氨基酸的分析分离2有效分配系数Keff：某一物质在层析系统中的行为并不直接决定于它们的分配系数Kd,而是取决于有效分配系数Keff。Keff＝某物质在A相中的总量/某物质在B相中的总量对于液相-液相层析系统来说,Keff＝(CA×VA)/(CB×VB)＝Kd×RV这里的VA,VB分别为A相和B相的体积，RV为A，B两相的体积比。由此可见，Keff是RV的函数，溶质的有效分配系数可以调整两相的体积比而加以改变。一、氨基酸的分析分离3

利用层析法分离混合物（例如氨基酸混合物），其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差异，哪怕是很小的差异，一般差异越大，越容易分开。

一、氨基酸的分析分离41．分配柱层析2．滤纸层析3．薄层分析4．离子交换层析5．气相色谱6．高效液相色谱（HPLC）1．分配柱层析1柱层析中的填充物或称支持剂，都是一些具有亲水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。以它们作为固定相（静相）。用各种缓冲液（流动相）来溶出。在柱上端加上氨基酸混合物样品，那么此样品就会在两相之间发生连续分配,混合物中具有不同分配系数的各种成分沿柱以不同的速度向下移动。分步收集柱下端的洗出液，用茚三酮显色定量。以氨基酸对洗出液体积作图，得洗脱曲线，曲线中的每个峰相当于某一种氨基酸。1．分配柱层析2洗脱剂样品填充物玻璃柱分步收集设想的板层S=固定相M=流动相1．分配柱层析3ABCDE321616816841241228812212345阶段1．分配柱层析4分溶曲线与转移次数（理论板数）n的依赖关系00.250.50.751.0相对浓度n=6n=100n=10002．滤纸层析1滤纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间，形成固定相，展层用的溶剂是流动相。层析时，混合氨基酸在这两相中不断分配，使它们分布在滤纸的不同位置，然后用茚三酮显色。此层析可以进行二向层析。第一向层析完成后，烘干滤纸再用另一溶剂层析（与第一向层析相垂直）。这种方法不仅可用于氨基酸分析，还可用于糖的分析和核苷酸的分析，是一个非常有用的方法。2．滤纸层析2AA1AA2AA3AA4abc标准样品原点原点（2）酚－甲酸－水（1）丁醇－醋酸氨基酸单向纸层析图谱氨基酸双向纸层析图谱DADS2．滤纸层析3氨基酸在纸上移动的速度称比移值或迁移率，以符号Rf代表。也就是原点到溶剂前沿的距离（Ds）同原点到层析斑点（即原色点）中心的距离(DA)的比值Rf＝DA/DS同一氨基酸对一定溶剂系统的Rf值是常数，因而可用来鉴别氨基酸。3．薄层分析这是近十几年发展起来的一种微量而快速的层析法。不仅适于氨基酸的分离鉴定，而且可用于许多其他的天然物质的定性、定量测定以及小量样品的分离提纯。大体步骤：把支持剂（硅胶粉、纤维素粉）涂布于玻璃板上，使之成一个薄层；把要分析的样品，滴加在薄层的一端，然后用合适的溶剂进行展层，使样品中各个成分分离；最后进行鉴定和定量测定。

4．离子交换层析1

就是用离子交换树脂作支持剂的一种层析法。离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯酸等不溶性高分子化合物。4．离子交换层析2

阳离子交换树脂含有的酸性基团如－S03H(强酸型)或－COOH（弱酸型）可解离出H+，当溶液中含有其他阳离子时，例如在酸性环境中的氨基酸阳离子，它们可以和H+发生交换而“结合”在树脂；相反，阴离子交换树脂，可解离出OH－，能和溶液里的阴离子（如碱性环境中的带负电的氨基酸）发生交换而结合在树脂上。为了使氨基酸从树脂柱上洗脱下来，需要降低氨基酸与树脂间的亲和力（静电吸引及氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水相互作用）。有效的方法是逐步提高洗脱剂的pH和盐浓度（离子强度），这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来。4．离子交换层析3RCHCOOHNH3++M1A+RCHCOOHNH3M1+A+

氨基酸（在酸性溶液中）阳离子交换剂

氨基酸盐RCHCOO－NH2+M2B－RCHCOOM2NH2+B－

氨基酸（在碱性溶液中）阴离子交换剂

氨基酸盐M1为酸性基团，M2为碱性基团5．气相色谱定义：层析系统的流动相为气体，固定相为涂渍在固体颗粒表面的液体，因此也叫气－液色谱。优点：气相色谱法具有微量快速的优点。缺点：但在分析生物成分方面存在一个限制，它要求样品能气化，且对热的稳定性高。而氨基酸由于含有各种极性基团，气化十分困难，必须把它转变成容易挥发的化合物才能进行气相层析。6．高效液相色谱（HPLC）这是近十几年内发展起来的一项快速、灵敏、高效的分析分离技术。其特点是使用的固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大。溶剂系统采取高压，因此洗脱速度增大。许多层析如离子交换层析、吸附层析及凝胶过滤层析等多种类型的柱层析都可用HPLC来代替。

二、蛋白质混合物的分离方法1．根据分子大小不同的分离方法2．根据蛋白质溶解度不同的分离方法3．根据蛋白质带电性的分离方法4．根据配体特异性的分离方法—亲和层析法

1．根据分子大小不同的分离方法（1）透析和超滤（2）密度梯度（区带）离心（3）凝胶过滤（分子筛层析）（1）透析和超滤1

利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。常用的半透膜是玻璃纸、火棉纸和其他合成材料。（1）透析和超滤2小分子溶出小分子被带出透析（1）透析和超滤3

超滤（2）密度梯度（区带）离心1蛋白质颗粒和沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度，常用的密度梯度为蔗糖梯度。蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带。（2）密度梯度（区带）离心2蔗糖浓度％4％8％12％16％20％塑料离心管滴加样品（3）凝胶过滤（分子筛层析）1

这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。凝胶珠是多孔的网状结构，凝胶的交联度或孔度（网孔大小）决定了凝胶的分级范围，即能被该凝胶分离开来的蛋白质混合物的分子量范围。（3）凝胶过滤（分子筛层析）2主要原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构而被排阻在凝胶珠外，随着溶液在凝胶珠之间的孔隙向下移动，并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外，这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离。大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。常用的凝胶:葡聚糖凝胶（sephadex）、琼脂糖凝胶(sepharose)聚丙烯酰胺凝胶（Biogel）（3）凝胶过滤（分子筛层析）3蛋白质混合样2．据蛋白质溶解度不同的分离方法（1）蛋白质的盐溶与盐析（2）等电点沉淀法（3）低温有机溶剂沉淀法

蛋白质溶解度的主要影响因素：1，溶液的pH；2，离子强度；3，介电常数；4，温度（1）蛋白质的盐溶与盐析1(盐溶1)盐溶：中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。机理：主要是蛋白质吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而且蛋白质分子与水分子间的相互作用加强，因而溶解度提高。在透析过程中，球蛋白分子沉淀析出，是因为除去了盐离子，使蛋白质之间相互吸引，引起蛋白质聚集。（1）蛋白质的盐溶与盐析1(盐溶2)等电点时，疏水基团相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种疏水作用力，使分子分散，溶于水中（1）蛋白质的盐溶与盐析2(盐析1)盐析：一般盐浓度增大时，蛋白质的溶解度趋于减低，当盐浓度足够大时，蛋白质可从溶液中完全沉淀出来，称为盐析。以硫酸铵（中性盐）最常应用。因其溶解度大，且不易伤害蛋白质。另外常用的盐还有硫酸钠、硫酸镁及氯化钠等。（1）蛋白质的盐溶与盐析2(盐析2)

蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，盐浓度高时，它们被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合、沉淀。（2）等电点沉淀法

蛋白质在等电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小（2）等电点沉淀法溶解度mgN/mlpH4.85.05.25.45.612305mM1mM10mM20mMpH和盐浓度对β－乳球蛋白溶解度的曲线

曲线上的数值为NaCl的浓度（3）低温有机溶剂沉淀法

加入与水可混溶的中性有机溶剂，特别是甲醇、乙醇、丙酮可降低多数蛋白质的溶解度并使之沉淀。3．根据蛋白质带电性的分离方法（1）电泳法（2）离子交换层析法（1）电泳法1原理：由于各种蛋白质在同一pH条件下因分子量及荷电量不同使其电泳迁移率就不同。常用的是区带电泳：所用支持物有滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂、淀粉、聚丙烯酰胺凝胶等。（1）电泳法2新近发展的等电聚焦区带电泳。是利用一种两性电解质作为载体放入电解槽中，通以直流电，两性电解质即形成一个由正极到负极的逐渐增加的pH梯度。当把蛋白质样品加入此系统时，带正电的蛋白质向负极移动，带负电的向正极移动，直至达到其等电点的pH的位置。此时蛋白质颗粒的净电荷为零,也就不再向任何一极移动，即聚集于其等电点的pH的位置。（1）电泳法3（平板电泳）（2）离子交换层析法阴离子交换剂或阳离子交换剂也可用于蛋白质分离。阳离子交换树脂含有的酸性基团可解离出H+，当溶液中含有其他阳离子时（如在酸性环境中的蛋白质阳离子），它们可以和H+发生交换而“结合”在树脂；相反，阴离子交换树脂，可解离出OH－，能和溶液里的阴离子（如碱性环境中的带负电的蛋白质）发生交换而结合在树脂上。常用的阳离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维（CM－纤维素）。常用的阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE－纤维素）。RCHCOOHNH3++M1A+RCHCOOHNH3M1+A+

氨基酸（在酸性溶液中）阳离子交换剂

氨基酸盐RCHCOO－NH2+M2B－RCHCOOM2NH2+B－

氨基酸（在碱性溶液中）阴离子交换剂

氨基酸盐（2）离子交换层析法M1为酸性基团，M2为碱性基团4．根据配体特异性的分离方法1原理：利用蛋白质分子能与其相对应的配体进行特异的、非共价的、可逆的结合来分离纯化。配体：指能与某些蛋白质进行特异结合的化合物，如配体的作用物及抑制剂、激素和受体、抗原和抗体、酶及底物等。4．根据配体特异性的分离方法3亲和色谱颗粒4．根据配体特异性的分离方法2首先需要制备有特异性配体的亲和层析柱。一般可将配体连接在琼脂糖颗粒上。蛋白质样品溶液通过此种特异的层析柱时，与此配体特异结合的蛋白质便被吸附而与其它物质分开。再用某些试剂将蛋白质与配体重新拆开而分离之。方法：三、蛋白质的定量检测1．凯氏定氮法2．双缩脲法3．福林－酚试剂法4．紫外吸收法（二）定量检测2(1凯氏定氮法1）原理：氮在蛋白质分子中含量恒定（平均占16%），因此测出样品中氮的含量后，即可求得样品中蛋白质含量。每克样品中含氮的克数×6.25×100=100克样品中蛋白质的含量（克%）将蛋白质样品用浓H2SO4

消化分解（加热、常加少量的硫酸铜、硫酸钾作催化剂），使其中的氮转变为铵盐，碳转变为CO2，硫转变为SO2、SO3等逸出。铵盐再与浓碱反应，放出的氨被酸（硼酸）吸收，滴定剩余的酸，算出氮的含量。（二）定量检测2(1凯氏定氮法2）NH3＋H3BO4HCl滴定(NH4)H2BO4NH4Cl+H3BO4（二）定量检测2(2双缩脲法）在碱性条件下，蛋白质或多肽（双缩脲的类似物）与硫酸铜反应能产生紫红色络合物，这种颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。将样品同标准蛋白质同时测定，并于540~560nm下比色，测光吸收值，通过标准曲线求蛋白质的含量。此法简便、迅速、但不太灵敏，所需样品量大，一般在0.2~1.7mg/ml。（二）定量检测2(3福林一酚试剂法）又叫Lowry法其原理是碱性铜试剂与蛋白质发生双缩脲反应，然后蛋白质中的酚基（如酪氨酸）在碱性条件下很容易将混合试剂（含有磷钼酸和磷钨酸）还原或蓝色的钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比，在650~660nm下测定光吸收值，即可测定蛋白质含量。此法比双缩脲法灵敏100倍。蛋白质测量范围在25~250mg/ml，因此是通用的方法之一。但其受还原剂、EDTA、Tritonx-100及酚的影响，并且蛋白质的种类不同，有较大的变动。（二）定量检测2(4紫外吸收法）由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸在280nm左右具有最大吸收，但各种蛋白质中的这两种氨基酸含量差别不大，所以在280nm吸收值与浓度成正比关系，可用于蛋白质含量测定。此法准确度较差，因为有诸多因素的干扰（如核酸），通常用280nm及260nm下的吸收差大概计算蛋白质的浓度

蛋白质浓度mg/ml=1.45A280－0.74A260由于此法非常简便，条件要求低，因此常作为粗略定量蛋白质的方法来使用。蛋白质结构中主键称为

键，次级键有

、

、

、

、

；次级键中属于共价键的是

键。蛋白质二级结构的基本类型有

、

、

和

。其中维持前三种二级结构稳定键的次级键为

键。蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，其稳定性主要因素有两个，分别是

和

。蛋白质处于等电点时，所具有的主要特征是

、

。作业1．组成蛋白质的20种氨基酸依据什么分类？各类氨基酸的共同特性是什么？2．蛋白质的基本结构与高级结构之间存在的关系如何？3．何谓蛋白质等电点？等电点时蛋白质的存在特点是什么？4．哪些因素可引起蛋白质变性？变性后蛋白质的性质有哪些改变？5．有哪些沉淀蛋白质的方法？其中盐析和有机溶剂沉淀法有何区别或特点？二、一级结构的研究方法11.样品必需纯（>97%以上）。2.知道蛋白质的分子量。3.知道蛋白质由几个亚基组成。4.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。5.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定蛋白质的一级结构的要求二、一级结构的研究方法2（一）测定氨基酸的组成（二）蛋白质的N-末端和C-末端的测定（三）二硫键的拆开和肽链的分离（四）肽链的部分水解和肽段的分离（五）肽段的氨基酸顺序的测定（六）二硫键位置的确定（二）蛋白质N-末端和C-末端测定1N-末端残基的分析1二硝基氟苯（DNFB）法（α-氨基反应）Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。（二）蛋白质N-末端和C-末端测定1N-末端残基的分析2二甲基氨基萘磺酰氯（称丹磺酰氯）法在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。（二）蛋白质N-末端和C-末端测定1N-末端残基的分析3异硫氰酸苯酯（PITC）法

此法最大优点是除去N末端氨基酸后剩下的肽链部分仍是完整的。因此，可以用来一步步地测定多肽链N末端的氨基酸顺序。氨基酸分析仪就是根据此原理制成的。NH2CH