双链DNA复制的分子机制课件

4、双链DNA复制的分子机制（以大肠杆菌为例）

双链的解开

RNA引物的合成

DNA链的延伸切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段4、双链DNA复制的分子机制1(1)双链的解开一些概念：

DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用ori(或o）表示。许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。大肠杆菌染色体DNA以及真核生物的细胞器DNA为双链环状，只有一个复制原点，而真核生物染色体DNA是线性双链分子，含有许多复制起点。从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组独立进行复制的单位）。(1)双链的解开一些概念：2复制原点由DnaA蛋白识别，在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶Π、SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。

DNA复制进行时，在眼的两侧出现两个叉子状的生长点(growthpoint)，叫复制叉。在复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为复制体（replisome）复制叉复制叉复制原点由DnaA蛋白识别，在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶3复制叉起点复制叉延伸延伸起点领头链领头链随后链随后链3’5’3’5’DNA的双向复制复制叉起点复制叉延伸延伸起点领头链领头链随后链随后链3’5’4（2）RNA引物的合成

引发体在复制叉上移动，沿模板链5’3’的方向移动，与复制叉移动的方向相同，识别合成的起始位点，DnaB蛋白活化引物合成酶。引发RNA引物的合成。领头链先引发开始合成，以原来一条DNA单链为模板（3’5’),按5’3’的方向合成一段RNA引物链。领头链开始合成后，随后链也开始合成其引物。引物长度约为几个至10个核苷酸，在引物的5’端含3个磷酸残基（引物酶的底物是核苷三磷酸），3’端为游离的羟基。RNA引物的合成称为“引发”。引发是一个十分复杂的过程，已经证明大肠杆菌、枯草杆菌和淋巴细胞等DNA的复制的引发需要一种称为“引物体”（primosome)的RNA合成系统。引物体是由引物合成酶和另外的几种蛋白质共同组成的。它可以沿模板链向分叉的方向前进，并断断续续地引发生成后随链的引物RNA短链。引物RNA一般只含少数核苷酸残基（原核生物约为100个核苷酸，真核生物约为10个核苷酸左右）。（2）RNA引物的合成引发体在复制5（3）DNA链的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四种脱氧核糖核苷5’-三磷酸为底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行领头链和随后链的合成。两条链方向相反。

领头链随后链冈崎片段半不连续复制冈崎模型（3）DNA链的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四种脱氧核糖6在DNA聚合酶Ⅲ的作用下，在引物的3’-端逐个添加与模板碱基顺序互补的脱氧核苷酸单位以完成冈崎片段或完整链的合成。然后通过DNA聚合酶Ⅰ的5’至3’的外切酶活性将RNA引物上的核苷酸单位逐个除去。每个核苷酸单位被切除后立即被与模板链相应位置碱基互补的脱氧核苷酸补上。这后一反应是利用前面的冈崎片段作为引物通过DNA聚合酶Ⅰ的聚合酶活性完成的。在DNA聚合酶Ⅲ的作用下，在引物的3’-端逐个添加与模板碱基7领头链—在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链。随后链—在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链。半不连续复制—在DNA复制时，领头链是连续合成的,而随后链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。发现（1968）：同位素实验，3HdT

短时间内为DNA小片段一段时间后检测到DNA大片段。当用DNA连接酶的变异株时，检测到大量DNA片段的积累。——证明DNA复制中有小片段合成。测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。由于U替代dT，被尿嘧啶-N-糖基酶切除。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。领头链—在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续8冈崎片段在DNA复制过程中，领头链能连续合成，而随后链只能是断续的合成53的多个短片段，这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。冈崎片段：真核生物中100-200个核苷酸（核小体的DNA单位）。原核生物中1000-2000个核苷酸（相当于一个顺反子）。冈崎片段9

1968年冈崎等用3H脱氧胸苷掺入噬菌体感染的大肠杆菌，然后分离标记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短是DNA片段，接着出现较大的分子。一般把这些DNA片段称为冈崎片段。进一步研究证明，冈崎片段在细菌和真核生物中普遍存在。细菌的冈崎片段较长，约有1000-2000个核苷酸；真核生物的较短，约为100-200个核苷酸。冈崎等最初做的实验不能判断DNA链的不连续合成只发生在一条链上，还是两条链都如此。后来进行了大量的实验证明，在DNA进行复制时，一条链是连续的，另一条链是不连续的。也就是说，聚合酶沿复制叉移动时，模板链为3’至5‘的一条链是连续合成的，而模板链为5’至3‘的一条链是不连续的。人们就将这种复制方式称为半不连续复制。

由于DNA复制酶系不易从DNA模板上解离下来，因此前导链的合成总是连续的。但由于很多因素可影响到前导链的连续性，例如模板链的损伤、复制因子和底物的供应不足等，都会引起前导链复制中断并从另一新点起始。1968年冈崎等用3H脱氧胸苷掺入噬菌体感染的大10（4）切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段（复制终止）

当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其3’-OH端遇到上一个冈崎片段时即停止合成。复制叉移动到终止区即停止复制（大肠杆菌有一个终止区）。这时会发生一系列变化：在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链；修复掺入DNA链的错配碱基；以修复方式填补终止区50-100bp的空缺。这样以两条亲代DNA链为模板，各自形成一条新的DNA互补链。结果是形成了两个DNA双股螺旋分子。（4）切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段11

连接是DNA连接酶的作用：各冈崎片段通过DNA连接酶相互连接最终形成后随链。DNA连接酶催化一个DNA链的5’-磷酸根与另一个DNA链的3’-羟基形成磷酸二酯键，但是这两个链必须都与同一个互补链结合，而且两个链必须是相临的，反应需要能量。

12DNA复制体的结构：DNA合成的生点，即复制叉上，分布着各种各样于复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA链上形成离散的复合体，彼此配合，进行高度精确的复制，这异结构称为复制体（replisome)。这种复制体于细胞内存在的一般游离体（例如核糖体)不同，复制体只是于复制叉DNA特殊结构相结合的蛋白质复合物。就现在所知，涉及DNA复制过程的酶和蛋白质因子共有30多种。右图为复制体的最主要成分和复制的过程示意图解。图中DNA复制叉上进行的基本过程包括：双链的解开；RNA引物的合成；DNA俩的延长；切除RNA引物，添补缺口，连接相临的DNA片段；切除和修复掺入DNA链的脱氧尿苷酸和错配碱基。DNA复制体的结构：DNA合成的生点，即复制叉上，分布13双链DNA复制的分子机制课件14双链DNA复制的分子机制课件155、真核DNA的复制：真核细胞DNA结构相当复杂，有关DNA复制的研究主要来自原核生物。但近年来，由于一些新技术的应用和体外复制系统的建立，真核细胞DNA的复制研究也有了较大进展。在真核细胞中也发现了冈崎片段、RNA引物、DNA连接酶和各种有关DNA螺旋分子解旋的酶和蛋白质。因此，真核细胞DNA的复制的过程可能十分相似于原核细胞DNA的复制。但两者相比，主要又下列不同之处：①真核细胞DNA的复制叉有多个起始点，即具有多个复制叉来完成，并且常是双向延长。而原核细胞常具一个复制叉。②真核细胞的冈崎片段较小，常为100-200个核苷酸；引物也较小，约为10个核苷酸。③真核细胞DNA复制的速度比原核生物慢，基因组比原核生物大。然而真核生物DNA上有多个复制点，所以复制的总速度可能比原核生物更快。④真核细胞的DNA在全部复制完成之前，起点不再从新开始复制，而在快速生长的原核生物，起点可以连续发动复制。⑤DNA聚合酶的作用有差别。原核具有3种聚合酶，真核具有4（或5）种聚合酶，且除了聚合酶δ外都不具有外切酶活力。⑥真核细胞线性染色体的末端DNA称为端粒（telomere）。端粒的复制由一种特殊的酶——端粒酶（telomerase）所催化。端粒酶是一核糖核蛋白，它由RNA和蛋白质连种成分组成。端粒酶最早于1985年在四膜虫细胞中发现，现知该酶在所有真核细胞中都可能存在且具有相似的结构和功能。5、真核DNA的复制：真核细胞DNA结构相当复杂，有关DN16复制叉复制叉终止区端粒结构3535端粒结构端粒酶是含RNA的逆转录酶复制叉复制叉终止区端粒结构3535端粒结构端17

DNA复制的其它方式大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制）真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）单向滚环式复制（噬菌体X174DNA—单链环状）3

D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）DNA复制的其它方式大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制18总之，DNA复制分子机制的基本特点是：1、复制是半保留的。2、复制起始于细菌或病毒的特定部位，真核生物有多个起始点。3、复制可以朝一个方向，也可以向两个方向进行，后者更为常见。4、复制时，DNA的两条链都从5‘端向3’端延伸。5复制时半不连续的，前导链时连续合成的，后随链时不连续合成的，即先合成短的冈崎片段，再连接起来构成后随链。6、冈崎片段的合成起始于一小段RNA引物，这一小段RNA以后被酶切除，缺口由脱氧核苷酸补满后再与新生DNA链连接在一起。7、复制有多种机制，即使在同一个细胞里，也可因环境——酶的丰富程度、温度、营养条件等的不同而具有不同的起始机制和链延长的方式。总之，DNA复制分子机制的基本特点是：19（二）反转录作用（RNA指导下的DNA合成）以RNA为模板，即按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反，故称为反向转录，又称为逆转录（revrsetranscription)。催化逆转录的酶，即RNA指导的DNA聚合酶（RNA-directedDNApolymerase），最初是在致癌病毒中发现的。

1970年，Temin，Mizufani和Baltimore分别从致癌RNA病毒中发现逆转录酶(reversetranscriptase),这就有力地证明了Temin的前病毒学说（provirustheory）：即致癌RNA病毒的复制需经过一个DNA中间体（即前病毒），此DNA中间体可部分或全部整合（integration）到细胞DNA中，并随细胞增殖而传递至子代细胞，细胞的恶性转化就是由前病毒引起的。前病毒学说的一个关键，即是认为遗传信息可以从RNA传递给DNA。在此传递过程中需逆转录酶。该酶催化的反应需要模板和引物，此外还需要适当浓度的二价阳离子（镁或锰）和还原剂（以保护酶蛋白中的巯基）；合成的方向也是5‘至3’。逆转录酶是一种多功能酶，它有三种酶的活力：1、它可以利用RNA作模板，在其上合成出一条互补DNA链，RNA-DNA杂种分子（RNA指导的DNA聚合酶活力）；2、还可以在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA链，形成双链DNA分子（DNA指导的DNA聚合酶活力）；3、它尚有核糖核酸酶H的活力，专门水解RNA-DNA杂种分子中的RNA，可沿3‘至5’和5‘至3’两个方向起核糖核酸酶的作用。逆转录过程的发现，有助于人们对RNA病毒致癌机制的了解，并对防止肿瘤提供了重要线索。（二）反转录作用（RNA指导下的DNA合成）20+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+病毒RNA的逆转录过程

（以前病毒形式引起整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化）

单链病毒RNA

RNA-DNA杂交分子双链DNA（前病毒）

逆转录酶逆转录酶

逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性：

RNA指导的DNA聚合酶活性

DNA指导的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA，可沿5’3’和3’5’两个方向起核酸外切酶的作用。逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿5’3’方向合成DNA，并要求短链RNA作引物。+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+逆转录酶逆转录酶21cDNA：几乎所有真核生物mRNA分子的3‘末端都有一段polyA,当加入寡聚dT作为引物时，mRNA就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与其互补的DNA，称为cDNA。逆转录酶发现的理论和实践意义：不能把“中心法则”绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。1983年，发现人类免疫缺陷病毒（humanimmunedeficiencevirus,HIV）,感染T淋巴细胞后即杀死细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）cDNA：几乎所有真核生物mRNA分子的3‘末端都有一段po22（三）DNA的损伤修复DNA的损伤：DNA在复制时产生错配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏DNA的双螺旋结构。从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。若DNA的损伤或错配得不到修复，会导致DNA突变。其主要形式：一个或几个碱基被置换插入一个或几个碱基一个或多个碱基对缺失

DNA的损伤修复——

四种修复途径:光复活、切除修复、复组修复和诱导修复（亦称暗修复）。（三）DNA的损伤修复23双链DNA复制的分子机制课件24

光复活：400nm左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上TT（CCCT）二聚体。（包括从单细胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无）切除修复：将DNA分子中的受损伤部分切除，以完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA连接酶均参与。（发生在DNA复制前）重组修复

（发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。P349诱导修复：造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOSresponse）。此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的DNA聚合酶。所以会有2种结果：修复或变异（进化）。

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紫外线照射可以使DNA分子中同一条链相临的两个胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体，这种二聚体是由两个胸腺嘧啶碱基以共价键连接成环形丁烷的结构而形成的，如右图。其他嘧啶碱基之间也能形成类似的二聚体。但数量有限。嘧啶二聚体的形成，影响了DNA的双螺旋结构，使其复制和转录功能均受到阻碍。细胞内具有一系列起修复作用的酶系统，可以除去DNA上面的损伤，恢复DNA的正常双螺旋结构。目前已经知道体内有两大修复系统，即无差错修复系统和有差错修复系统。紫外线照射可以使DNA分子中同一条链相临的两个261、无差错修复系统：此中修复系统可使受损伤的DNA完全得到修复，恢复原有的结构和功能。主要包括光复活修复（photoreactivationrepair）和切除修复（excisionrepair）。（1）光复活修复：早在1949年即已发现光复活现象。稍后一些时间就了解到光复活的机制是可见光（大约在400nm）激活了光复活酶，它能分解由于紫外线照射而形成的嘧啶二聚体。光复活作用是一种高度专一的修复方式，它只作用于紫外线引起的DNA嘧啶二聚体。该酶在生物界分布很广，从低等的单细胞生物到鸟类都有，而高等的哺乳类却没有。这说明在生物进化过程中该作用逐渐被暗修复系统所取代，并丢失了这个酶。（2）切除修复：也称为暗修复，即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢复正常结构的过程。这是一种比较普遍的修复机制，对多种损伤均能起修复作用。参与切除修复的酶主要有：特异的核酸内切酶、外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶。1、无差错修复系统：此中修复系统可使受损伤的DNA完全得到修27

修复过程包括四个步骤：即识别、切除、修复合成、连接（或者是识别、修复合成、切除、连接），如右图。识别：专一性的核酸内切酶在靠近二聚体（或其他损伤处）处切断单链DNA。修复：DNA聚合酶利用完整的互补链为模板，在断口处进行局部的修复合成。切除：5‘-核酸外切酶切去含二聚体（或其他损伤）的寡核苷酸片段。连接：DNA连接酶在提供能量的基础上将新合成的DNA链与原来的DNA链连接在一起。修复过程包括四个步骤：即识别、切除、修复合成、连接28双链DNA复制的分子机制课件292、有差错修复系统：在这种修复系统中，受损伤DNA并不因修复而除掉损伤部位，但随着修复的进行，受损伤DNA的浓度越来越低，从而消除损伤的影响。主要包括重组修复（recombinationrepair）和SOS修复（SOSrepair）。（1）重组修复：重组修复是发生在DNA复制后的一种修复系统。在复制时，受损伤部位可被跳过，结果在子代链在损伤相对应处留下一缺口，这种遗传信息有缺损的子代DNA分子可通过遗传重组而加以弥补，即从完整的母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处，然后用再合成的序列来补上母链的空缺（如右图）。此过程称为重组修复，因为发生在复制之后，故又称为复制后修复。2、有差错修复系统：在这种修复系统中，受损伤DNA并不因修复30双链DNA复制的分子机制课件31（2）SOS修复：前面介绍的DNA损伤修复功能可以不经诱导而产生，然而许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOSresponse）。SOS反应包括诱导出现的DNA损伤修复效应、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等。细胞的癌变也可能与SOS反应有关。

SOS反应是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的应急反应。SOS反应诱导的修复系统包括避免差错的修复（errorfreerepair）和倾向差错的修复（errorpronerepair）两类。光复活、切除修复能够识别DNA的损伤或错配碱基而加以消除，在它们的修复过程中并不引入错配碱基，因此属于避免差错的修复。SOS修复能诱导切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生，使这些酶和蛋白质在细胞内的含量升高，从而加强切除修复和重组修复的能力。此外，SOS反应还能诱导