整个基因克隆实验流程(完整)

整个基因克隆实验流程2相关试剂：Trizol;氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器(1ml相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头(1ml,200μl/300μl)1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg,放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗2.转移到离心管中，室温放置5min,使细胞充分裂解；4.4℃,,12000g离心15min;此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；6.室温放置10min;4℃,,12000g离心10min;7.弃上清，加入1ml75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃,,12000g离心8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；(RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解)子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机)值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和(2)RNA完整性的检测：取2uIRNA,与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，3且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性根据逆转录试剂盒(TOYOBO公司)说明书进试剂使用量(μl)1Y试剂使用量(μl)dNTPMixture(各10mM)2TotalVolume20然后放置于PCR仪上，反应程序为：42℃,60min;99℃,5min;16℃,5min。所试剂使用量(μl)反转录产物Taq酶(1U/μl)反应条件：95℃,预变性3min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环；72℃延伸10min。4相关试剂：胶回收试剂盒相关仪器：(紫外照胶仪，移液器(200μl,1ml规格),离心机，恒温金属浴，涡旋混匀仪，制冰机，超微量分光光度计)相关仪器：(超净工作台，离心机，恒温培养箱，恒温摇床，恒温金属浴/水浴锅，移液器(1000μl,100μl,10μl,2.5μl规格)涡旋混匀仪，制冰机)CaCl₂法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞全过程冰上进行，4℃离心，无菌操作。(1)以接种环从-80℃保存的高效转化菌种蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12h;(2)挑取单菌落接种于1ml无抗生素LB培养基中，37℃剧烈震荡培养6h;(3)按1:100接种菌液于25mlLB液体培养基中，37℃震荡培养1.5～2h,至ODso达0.4～0.6;(这一步非常关键，培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA的能力较低，从而导致转化率降低)(4)冰上预冷10min;然后4℃,6000rpm离心10min;(6)弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于25ml预冷的0.1MCaCl₂中，冰浴(8)以1.25ml(菌液体积的5%)预冷的0.1MCaCl,溶液重悬细菌沉淀，同时加入0.3ml预冷的100%甘油(甘油终浓度达15～20%),混匀后按每支100μl连接产物转化到感受态细胞(1)将10μl连接产物加入100μl感受态菌液中，冰上放置30min;(2)然后放到42℃水浴锅中热激90s,再在冰上放置3min;(3)加入890μlLB液体培养基，37℃震荡培养60min;5经1%琼脂糖凝胶电泳检测是否含有目的条带主要溶液和培养基的配制6DEPC水65℃,5min;立即置于冰上。第一步变性后的RNA溶液dNTPMixture(各10mM)总体积反应条件：42℃,60min;99℃,5min;16℃,5min。利用胶回收试剂盒进行(去除多余的dNTP和引物)。最后使用20μlTE洗脱沉OligodT接头引物(10μmol/L)3'RACE外引物(10μmol/L)Taq酶(1U/μl)反应条件：降落PCR。PCR产物稀释10倍作为模板进行下游实验。接头引物(10μmol/L)3'RACE内引物(10μmol/L)Taq酶(1U/μl)反应条件：降落PCR。7DEPC水基因特异性反义引物65℃,5min;立即置于冰上。dNTPMixture(各10mM)总体积反应条件：42℃,60min;99℃,5min;16℃,5min。利用胶回收试剂盒进行(去除多余的dNTP和引物)。最后使用20μlTE洗脱沉纯化后的cDNA5×末端转移酶缓冲液末端转移酶(30U/μl)总体积反应条件：37℃,60min;70℃,10min。反应结束，把cDNA稀释1倍作模板进O