葡萄糖酶传感器课程设计

生物医学传感器测量与信号处理课程设计报告姓名： 学号： 班级：生物医学工程目录TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"一、 设计题目 4\o"CurrentDocument"二、 设计目的 4\o"CurrentDocument"三、 设计内容 4\o"CurrentDocument"四、 设计要求 4\o"CurrentDocument"1、 引言 4\o"CurrentDocument"2、 国内外现状分析 53、设计原理及逻辑框图 64、分析与讨论 115、 结论（展望） 16\o"CurrentDocument"6、 设计心得体会 16一、 设计题目：尼龙网为固定酶载体的葡萄糖传感器设计二、 设计目的：1、 掌握生物医学传感器的应用2、 熟悉传感器的一般结构，掌握简单传感器电路的设计方法。3、 通过设计，掌握一般葡萄糖传感器设计方法，熟悉葡萄糖检测的原理。三、 设计内容：设计一个可以测量葡萄糖的生物传感器，主要是检测葡萄糖的浓度，可用于人体血糖、发酵罐内葡萄糖、部分实验室等场合的葡萄糖检测与控制四、 设计要求：1、引言葡萄糖是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，它是一种多羟基醛。纯净的葡萄糖为无色晶体，有甜味但甜味不如蔗糖，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。植物可通过光合作用产生葡萄糖。葡萄糖有许多重要的作用。葡萄糖是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质。它的氧化反应放出的热量是人类生命活动所需能量的重要来源。 葡萄糖在医学上主要用作注射用营养剂（葡萄糖注射液）；食品工业上葡萄糖经异构酶处理后可制造果糖，尤其是含果糖42%的果葡糖浆，其甜度同蔗糖，已成为当前制糖工业的重要产品。在食品、医药工业上可直接使用，在印染制革工业中作还原剂，在制镜工业和热水瓶胆镀银工艺中常用葡萄糖作还原剂。工业上还大量用葡萄糖为原料合成维生素C（抗坏血酸）。葡萄糖可以作为身体健康状况的指标。如检测糖尿病，高血糖等疾病。临床上做

糖尿病的诊断试验时，通常是测定静脉空腹血糖。当静脉空腹血糖 <5.0mmol/L，可排除糖尿病；当静脉空腹血糖>7.0mmol/L并且有临床症状时，则可以诊断为糖尿病；而当静脉空腹血糖在5.5〜7.0mmol/L之间并且怀疑糖尿病时，要做进一步实验，早期发现糖代谢异常，早期诊断糖尿病。一旦血糖下降到 80毫克％时可能出现糖尿现象。国家规定，用葡萄糖酸的钾、钠、钙、锌、铜、铁、锰等作为人体营养强化剂及药用补充剂，均有很好的治疗效果。长期的、科学合理的服用，对一个民族身体素质的提高是不言而喻。所以，对葡萄糖的检测，有非常重要的价值。作为生物医学工程专业这一交叉边缘学科的学习者，我非常希望利用已经学习的知识，制作一种传感器，完成对葡萄糖浓度的测量，以便应用于用于人体血糖、发酵罐内葡萄糖、部分实验室等场合的葡萄糖检测与控制。2、国内外现状分析随着我国逐渐步入老龄化社会和人们生活水平的不断提高， 糖尿病的发病率呈明显上升趋势。目前我国糖尿病发病率已达到3%，非常接近于欧美发达国家。全世界约有两亿多糖尿病患者，已成为全球性的卫生保健问题，成为仅次于心血管病、癌症的第三大危险疾病，严重威胁着人类的健康。因而糖尿病的诊断和治疗不仅是我国，也是全世界医学界面临的重大课题。长期研究工作已充分表明，如果葡萄糖浓度能够严格维持在正常生理范围内，糖尿病就可以得到控制，由此产生了一系列适于测量体内、外生理溶液中葡萄糖浓度的葡萄糖检测手段。除了临床葡萄糖分析，葡萄糖检测在食品工业及其他生物技术领域也具有非常重要的意义。到目前为止，测定葡萄糖的方法很多，如分光光度法、电流测定法、高效液相色谱法、极谱法及毛细管电泳法等，但是己经采用的这些方法分析速度慢或成本太高。而生物传感器克服了传统分析方法的缺点，它具有操作简单、响应速度快、灵敏度高、选择性好等优点，在众多分析手段中极为引人注目，对糖尿病的诊断有独到之处。按生物传感器中感受器所用生物材料的不同，可分为电化学免疫传感器、微生物传感器、酶传感器、细胞传感器、组织传感器、电化学DNA传感器等。按照传感器器件检测的原理分类，可分为场效应生物传感器、热生物传感器、声波道生物传感器、光生物传感器、压电晶体生物传感器、介体生物传感器、半导体生物传感器等。根据基底电极的不同可以分为汞电极（主要是悬汞电极）传感器和固体电极（包括半导体金属氧化物电极，金电极，碳电极等）传感器。葡萄糖生物传感器，是将酶催化的生化反应信号转换成不同类型的物理信号加以输出的装置。第一代电流型葡萄糖生物传感器，其工作原理是通过固定化的葡萄糖氧化酶催化底物葡萄糖被环境中氧气氧化，生成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在碳或金属基电极上在一定工作电位下产生电流响应，从而根据电流信号的测量结果对葡萄糖定量。这种葡萄糖生物传感器是以氧化还原酶的天然电子受体一氧气来作为酶的氧化还原活性中心的电子受体的，由于过氧化氢在较高的正电位下发生阳极氧化过程，因此人体内源性物质例如抗坏血酸、尿酸等，即使处于各自生理低浓度，也会在碳或金属基电极上被氧化导致氧化电流信号的迭加而产生干扰。为了改进习见的第一代酶电极的设计，消除上述干扰，人们进行了不断的探索研究，发展了许多技术策略。比如改用非生理性的人工合成的电子受体取代氧气，研制出第二代电流型葡萄糖酶生物传感器。它们通过人工电子受体将电子从葡萄糖氧化酶的黄素氧化还原中心转到基电极表面产生电流信号，使得电流分析可以在较低的正电位以至负电位下实现，从而消除内源性物质氧化的干扰。然而这些人工的电子受体通常是金属有机化合物，其生理毒性问题大大限制了传感器在体内检测葡萄糖的应用。人们还基于酶与电极之间的直接电子传递进行检测而研制了第三代电流型葡萄糖酶生物传感器。第三代酶生物传感器是指在无媒介体存在下，利用酶与电极间的直接电子传递设计制作的酶传感器，是生物传感器构造中的理想手段。由于生物酶分子活性中心深埋在分子内部，使得酶与常规电极之间直接电子传递较为困难，因此基于直接电子传递的生物传感器虽已见于报道，但这些生物传感器的性能并不太理想，存在若干问题，主要是电子传递速率不高，另外这一类传感器还仅仅涉及少数几个氧化还原酶和氧化还原蛋白。总之，第三代生物传感器仍处于探索阶段，要发展到广泛应用阶段还有一段很长的路要走。在电化学酶生物传感器的构建中，一项关键技术是如何将酶稳定而高活性地固定在换能器表面，即酶的固定化技术。它必须兼顾酶的活性和固定化酶的牢固性两个方面，酶的固定化技术决定着电化学酶生物传感器的稳定性、灵敏度等主要性能。不同的固定化方法有不同的优点与缺陷，适用于不同的酶蛋白的固定。酶的固定方法影响传感器的各个性.比如稳定性、灵敏度、响应时间等。目前酶的固定方法有：包埋法，吸附法，共价法，交联法，静电层层自组装法等

3、设计原理及逻辑框图（描述一般原理或方案设计即可，可用画图表示）葡萄糖酶传感器的原理：葡萄糖传感器基本由酶膜和Clark氧电极或过氧化氢电极组成，如图：葡萄糖菌萄械氧化酶莆萄摭内酸电子葡萄糖菌萄械氧化酶莆萄摭内酸电子画电极传感器测量葡萄糖©在葡萄糖氧化酶（GOD）的催化作用下，葡萄糖（C6H12O6）发生氧化反应，消耗氧气（O2）生成葡萄糖酸内酯（C6H10O6）和过氧化氢（H2O2）。GOD被半透膜通过物理吸附的方法固定在靠近伯电极的表面，其活性依赖于其周围的氧浓度。葡萄糖与GOD反应，生成两个电子和两个质子。反应方程式为：被氧及电子质子包围的还原态GOD经过反应后，生成过氧化氢及氧化态GOD，GOD回到最初的状态并可与更多的葡萄糖反应。葡萄糖浓度越高，消耗的氧越多，生成的过氧化氢越多。葡萄糖浓度越少，则相反。因此，氧的消耗及过氧化氢的生成都可以被伯电极所检测，并可以作为测量葡萄糖测定的方法。生物传感器一般由敏感基元（感受器）、信号转换器（换能器）和信号处理器三部分组成如图：

邮膜换能暑 信号处理朔邮膜换能暑 信号处理朔其工作原理是:当待测物与敏感基元进行特异性结合后，产生光学、热学、压电学或电化学等响应信号，信号转换器敏感地捕捉到这一信号，将其转换成可表达的物理信号等，再经信号处理器经放大等一系列处理并将其输出，其信号大小与分析物含量或浓度存在定量关系，从而实现了对待测物的定量测定。在生物传感器的构建中，如何将生物活性组分稳定、高效地固定到换能器表面是成功构建传感器的关键，它决定着生物传感器的重现性、灵敏度、线性范围、检出限及稳定性等主要性能，同时也决定生物传感器是否具有研究和应用价值。为使生物传感器响应良好，其固定化技术应满足以下几个条件：生物活性组分固定化后活性应尽可能少受影响，保证传感器高的灵敏度和选择性；固定化层对被测物的传质阻力小，保证传感器的快速响应：生物活性组分固定化牢固，不易洗脱，保证传感器有较长的使用寿命；生物固定化层与转换器紧密接触，并能适应多种测试环境；生物固定化层最好具有一定的抗干扰能力。生物活性组分的固定化方法大致有四种:吸附法、包埋法、化学键合法、交联法吸附法是酶在电极表面的吸附，其中物理吸附是一种较为简单的固定化技术，它是通过静电作用、氢键、疏水作用等非共价作用将酶固定于不溶性载体上的方法。它一般通过挥发含酶的缓冲溶液来进行，温度通常选择在4°C，因此酶不会发生降解，该方法具有条件温和，无需化学试剂，酶活性中心不易被破坏等优点，这种固定化酶的方法在生物传感器中的应用非常广泛。包埋法是指将酶包埋于高分子材料的三维空间网状结构中，形成稳定的敏感膜。它分为网格型和微胶囊型两种，将酶包埋在有机基质和无机基质材料的凝胶细微网格中的称网格型，而将其包埋在高分子半透膜中的称微胶囊型。该法可采用温和的实验条件将酶掺入到高分子膜中，不涉及酶分子的化学变化，对酶的活性影响小，且膜的厚度和孔径可以人为调节，其作为酶固定化方法在生物传感器中应用很广。共价键合法是酶蛋白分子上的官能团与不溶性载体以共价键结合而固定的方法称为共价键合法。其归纳起来有两类:一是将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应，另一种就是在载体上接一个双功能试剂，然后再将酶偶联上去。交联法是借助交联剂（具有两个或多个以上功能基的试剂）使酶分子之间或酶蛋白与凝胶/聚合物之间交联，形成网状结构而使酶固定化的方法称交联法此外还有新型的固定酶技术。如分子自组装和纳米粒子修饰技术。分子自组装是指分子之间靠非共价键作用力（包括静电作用、范德华力、疏水作用力、氢键等）自发形成热力学上稳定的、结构上确定的、性能上特殊的一维、二维甚至三维有序的空间结构的过程，它实现了按人们所预想次序排列的在分子水平上设计和制造的分子组合体系，所以它不仅对研究一些自然科学基本问题如界面电子转移理论、分子间相互作用等具有重要意义，而且所得膜有序、致密、均匀、操作简单等，其作为表面改性技术在生物传感器方面具有极好的应用前景。纳米粒子修饰技术：纳米材料是纳米科学技术的重要基础，是尺寸小于100nln（0.1一100lun）的超细颗粒或纤维等构成的材料总称。由于纳米级尺寸与光波波长、德布罗意波长等物理性质特征尺寸相当或更小，使得晶体周期性的边界条件被破坏;纳米微粒的表面附近的原子密度减小；电子的平均自由程极短，而局域性和相干性增强。这种变化使得纳米材料产生在宏观尺度上完全看不到的或者特别优异的不同于常规材料的性质。纳米粒子越来越多与分子自组装将纳米颗粒修饰到换能器表面，形成纳米活性接口来固定生物材料，纳米粒子的参与使得传感器的响应性能得到进一步的提高。选用尼龙作为固定酶的载体。尼龙是经二酸和二胺缩水反应、通过酞胺键连接起来的惰性高分子化合物，其具有原料来源丰富，价格便宜，且尼龙机械强度高等优点。但因其化学惰性是不能直接键合上酶的，所以首先对在生物传感器中作为固定酶载体的尼龙网进行化学修饰即活化，然后再固定酶。其中活化尼龙网的方法很多:首先水解，然后以环己基异睛或戊二醛为交联剂将酶固定于尼龙网上;或先嫁接上缩水甘油基异丁烯酸盐或丁基异丁烯酸盐，然后以戊二醛为交联剂将酶固定于尼龙网上。与上述活化方法相比，尼龙网先用硫酸二甲酷氧烷基化，然后与赖氨酸反应，最后连接上双官能团试剂的活化方法操作简单而且成本低，是比较好的活化尼龙网方法。采用经活化好的尼龙网作载体制作的分子识别元件具有它具有机械强度高、多孔、亲水、气液通透性好和抗细菌侵蚀等优点［4］。其与氧电极组成的酶传感器，尼龙网多次拆卸不会损坏，而且不易受其他物质的干扰。本章以活化好的尼龙网为固定酶载体制成葡萄糖生物传感器，通过氧电极测定葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下氧化消耗的氧气的量即可求出葡萄糖的含量，并对实际样品人血清进行了分析测试。传感器制备的过程：1仪器与试剂PaseoCl一6542溶解氧传感器和seienceWorkshop500数据处理系统（paseoSeientifie，Roseville，CA），PHS一3C型精密酸度计（上海雷磁仪器厂），81一2型恒温磁力搅拌器（上海凯欣仪器厂），752N紫外可见分光光度计（上海精科）。葡萄糖氧化酶（51脚a，酶活力为234900Units/g），戊二醛（25%，北京化学试剂公司），p一D—葡萄糖（Acrosorghacs）。尼龙网（浙江天台华龙过滤材料公司），葡萄糖试剂盒（100mLxZ，中生北控生物科技股份有限公司），NaZHPO4书aHZPO;，NaZHPO4一aOH和NaHZPO4--Hcl缓冲溶液，其它试剂均为分析纯，实验用水为石英亚沸二次蒸馏水。2酶电极的制备取一直径15・20mm活化好的尼龙网，用0.IM氯化钠溶液冲洗干净，并将其铺于一表面皿上，在其滴加适量的葡萄糖氧化酶溶液，室温中放置2小时后置于冰箱中冷藏过夜。后用磷酸缓冲溶液（0.05m。比PH=7）反复冲洗。将固定有酶的尼龙网片紧贴于氧电极顶端并用一个“O”型环固定于氧电极表面即成酶电极。3测定方法将固定有酶的尼龙网紧贴于氧电极顶端并用一个“O”型环固定于氧电极表面即成酶电极，将制备好的酶电极浸入smL被空气饱和的磷酸缓冲溶液（300mmol几，PH=7）中，在均匀搅拌下用注射器加入不同体积的葡萄糖标准溶液和待测溶液，电极电位的变化被输入计算机数据处理器中，并以溶解氧浓度变化的形式输出，一记录溶解氧浓度下降曲线，用标准曲线法即可测得葡萄糖的含量。4、分析与讨论(方案的优点，可能存在的问题及解决方法)优点：与传统的分析方法比较，生物传感器这种新的检测手段具有如下优点：：生物传感器是由选择性好的生物材料构成的分子识别元件，因此，一般不需要样品的预处理，样品中的被测组分的分离和检测同时完成，且测定时一般不需要加入其它试剂。由于它的体积小，可以方便实现连续在线检测。响应速度快，样品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可多次使用。传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器，便于推广使用。由于酶的专属反应性，使其对底物具有高度的专一性(特异选择性)，能够直接在复杂试验中进行测定一些特定物质，加上具备测定迅速准确、简单便宜。采用尼龙网作载体制作的生物活性敏感材料，具有保持生物活性、机械性能好、使用寿命长、多次拆卸不损坏、气液通透性好，它与氧电极组成的葡萄糖生物传感器具有选择性好、响应快速、重现性好、制备简便、使用寿命长等优点，尼龙网是固定酶的良好载体。问题及解决：1、葡萄糖生物传感器的响应行为将电极浸入smL被空气饱和的磷酸缓冲溶液(300mM，PH=7.0)中，搅拌条件下加入不同体积的葡萄糖标准溶液，溶解氧浓度下降曲线如图1所示，这是本实验定量测定葡萄糖浓度的基础。可能存在的问题是由于反应过程中，氧气浓度浓度不均匀造成反应测量结果的不准确。可以加入搅拌装置，增强溶液的流动性，以保证结果的准确性。00 100200 300 43000 100200 300 4305009765432PVAO%一QTime(s)图1传感器对连续•加入不同眦珈蜀糖溶液的溶髀筑浓度的变化曲践2、固定酶量的影响在活化好的尼龙网上分别滴加含酶量为0.2、0.6、0.8、1.2、1.4mg的酶溶液制得一系列酶膜（其具体固定酶的化学反应方程式如图），并与氧电极偶联制得葡萄糖生物传感器。在smL的底液中加入一定量的葡萄糖标准溶液，一记录溶解氧浓度下降曲线（所得结果见图3）。从图可以看出:酶量从0.2—o.8mg，溶解氧浓度下降值随着酶量的增加而急剧增加，但是当酶量大于o.8mg却增加平缓，可能是作为交联剂的戊二醛量一定的缘故。所以为了避免酶量不同对葡萄糖催化作用带来测量误差，要保证反应过程酶量一定。HQ.6 0.8LQI..2 J.4Theamouniofenaymefmg)

3、缓冲溶液pH值的影响分别在浓度为300mmo比pH=3、4、5、6、7、8、9、10的磷酸缓冲溶液中注入一定量的葡萄糖标准溶液，记录溶解氧浓度下降曲线（所得结果如图），从图中可以看出:pH从4一9溶解氧浓度下降值变化幅度不大并且7是响应值最大，但当pH<3或>10时，溶解氧浓度下降值明显偏低，可能是过酸或过碱破坏了酶的结构而失去活性的缘故，所以要保证传感器的ph值稳定在酶的最适ph值附近。153川151一，EJIvi>uq-E心afixxEJIvi>uq-E心afixxGUT在用恒温水浴控制温度分别为10°C、20。。、25。。、30°C、35°C、40°C、45°C的磷酸缓冲溶液（200mmol/L，PH=7）中，注入一定量的葡萄糖标准溶液，记录溶解氧浓度下降曲线（所得结果见图），从图可以看出：随着温度的升高，溶解氧浓度下降值增大，即葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化速度增大，但是考虑到恒定的高温条件不好控制，且长期在高温条件下操作的酶膜容易失活，因此必须确保传感器工作在适宜的温度。

5、离子强度的影响分别在浓度为25、50、100、200、300、400、50Ommol/L的缓冲溶液中分别加入一定量的葡萄糖标准溶液，记录溶解氧浓度下降曲线(所得结果见图)。从图可以看出：随着离子强度的增加，溶解氧浓度下降值增大，当缓冲液的浓度小于300mm/L，电极的响应时间大约805,但是当缓冲液的浓度大于300mmol/L，电极的响应时间增长达120s，所以要保证传感器中酶工作在适宜的缓冲液浓度中。R76R76s4-1(，2^88)-s£ll口蚩Ax#n6、传感器的响应性能⑴响应时间在300mMpH=7.0的磷酸缓冲溶液中测定0.5mM葡萄糖标准溶液，记录从加样到溶解氧浓度基本平衡时的值，平均响应时间为805。(2)线性范围、检测限、精密度葡萄糖浓度在18林Mwel.10mM之间呈现良好的线性范围，以空白值的3倍标准偏差计算传感器的检测限为9两，对0.smM的葡萄糖溶液重复测定10次，RSD=3，38%。(3)使用稳定性、贮藏稳定性和操作稳定性以0.5M葡萄糖溶液测定传感器的响应情况，每张膜可使用220多次后，响应值变为初始值的86.3%。在测定间隔置键合有酶的尼龙网于4°C的磷酸缓冲溶液中，50天后，响应值变为初始值的83%,可能是尼龙网有抗细菌侵蚀的缘故。这说明此传感器具有较长的使用寿命。将不同的3片尼龙网分别装配到氧电极上，以0.smM葡萄糖溶液测定尼龙网的响应情况，测得的溶解氧浓度下降值依次为4.14mg/L、3.94mg/L、4.14mg/L，平均值为4.07mg/L。7、电极的选择性对实际样品血液中存在的物质(氨基乙酸、DL—a一氨基丙酸、尿素、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化钱等)对葡萄糖的测定可能存在干扰进行了测定，并将其换算成产生相同响应信号时葡萄糖的含量，结果如表1所示:这些物质对葡萄搪的测定基本不产生干扰。干扰物干扰物维度(mmol/L)相当于产生相同信号的曲萄糖的浓度(inm&l/L) 氯基乙酸20-0.0325丙胺或2。-0.Q网5MgSO.20-O.OOMNH4CI20-0.0154CaCb200,00096KC1200.0106NaCI20-0.0096尿素200.0048尿酸200.0133抗坏血酸 2。 0.07108、实际样品的分析测定将样品人血液于离心机中4000r/m离心1smin，取上清液，用磷酸缓冲液将其稀释至葡萄糖的线性范围内，用该生物传感器对实际样品进行测定，并与葡萄搪试剂盒所测结果基本吻合。并对实际样品进行了回收率实验，结果列于表2。该方法的回收率在95%—104%之间，说明该电极具有较高的可靠性。葡萄捋的浓度(mmoUL)— J—,、Vl-r回牧浓度Id.14击相对标样传感器回收率推潟差(mmol/L)1品试剂盒方法(mmolJL)(%)方法'的13.323.415555.25952324.524135.555.35卯$.534.013785.555,761。4a5、结论(展望)葡萄糖传感器的发展非常迅速，目前在医学和工业等多领域得到了广泛的应用。但是，仍然有很多存在的问题，测量的精度和环境受到制约，目前有多种先进的物质如纳米技术等被应用到葡萄糖传感器的测量中，为葡萄糖传感器的发展提供了更为广阔的空间，我相信，随着科学技术的进步，葡萄糖的测量一定得到更广阔的发展，测量精度，环境限制，产品成本等会得到优化，越来越多的领域会应用到这种测量，总之，随着集成微光、机，电系统技术的发展以及光导.光纤、超导。纳米技术，智能材料等新技术的应用.将会出现大量的生物传感器。这些传感器通过进一步的信息采集与传输、处理集成化，智能化.将具有自检自校.量程转换、定标和数据处理等功能，葡萄糖生物传感器的功能必将得到进一步增强和完善，性能必将进一步