西科大张F改进后酶活测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠一次氯酸钠比色法）一、 原理月尿酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤月尿酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤尿酶活性较高，中性土壤尿酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤尿酶活性表征土壤的氮素状况。土壤中尿酶活性的测定是以尿素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚一次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析尿酶活性。二、 试剂1） 甲苯2） 10%尿素：称取50g尿素，用水溶至500ml。3） 柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7,用水稀释定容至1000ml。4） 苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml定容，需配制250ml（将A液、B液各50ml混合，用蒸馏水稀释至250ml定容）。5） 次氯酸钠溶液：取40.9g次氯酸钠试剂用水稀释至250ml定容，至活性氯的浓度为0.9%，该溶液见光易分解，需现配现用避光保存。6） 氮的标准溶液：精确称取0・4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液;再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0・01mg/ml）。试剂综合甲苯尿素柠檬酸氢氧化钾NaOH苯酚乙醇甲醇丙酮次氯酸钠硫酸铵三、操作步骤称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20mlPH6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37°C恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。汪意事项：1、 每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。2、 整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。

3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样四、结果计算：以24小时后1g土壤中NH3-N的毫克数表示土壤月尿酶活性（Ure）。Ure=（a样品一a无土一a无基质）Xn/m式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数;a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数;a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数;n为分取倍数，浸出液体积/吸取滤液体积；m表示土壤样品质量（g）法二土壤脲酶测定（改进的）法二土壤脲酶测定（改进的）待测土样风干，过80目筛。精确称取0.500g土样于10ml圆底塑料离心管中，加入0.2ml甲苯，振荡摇匀。15分钟后，加入2ml10%尿素溶液和4mlpH=6.7的柠檬酸盐缓冲液，加盖摇匀，于37°C培养24小时。取出后摇匀，于3800r离心5分钟，吸取上清液0.6ml于10ml试管，加入3.4ml蒸馏水，再加入0.8ml苯酚钠溶液和0・6ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。待30分钟后显色，【加入4.6ml蒸馏水，定容至10ml】。于1小时内，在578nm下比色，记录光吸收值。标准曲线的绘制：精确称取0.0472g硫酸铵，加蒸馏水溶解，定容至1L，则1ml含0.01mg氮的标准溶液。分别吸取氮的标准溶液0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0、3.4、3.8、4.0ml于10ml离心管中，对照组不吸取氮的标准溶液，分别加入蒸馏水至4ml，再加入0.8ml苯酚钠溶液和0.6ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。待30分钟后显色，加入4.6ml蒸馏水，定容至10ml。于1小时内，在578nm下比色，记录光吸收值。以标准溶液浓度为横坐标，以光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。磷酸单酯酶(对硝基苯磷酸盐法)(Tabatabai,1994)1、 原理：磷酸单酯酶水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后释放的对硝基苯酚的含量，来估算磷酸单酯酶的活性。酸性和碱性磷酸酶的活性可以通过控制反应的pH值来分别测定。该方法以对硝基苯磷酸二钠(即pNPP)为基质，基质在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色的对硝基苯酚(即pNP),该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性，采用的是对硝基苯磷酸二钠比色法2、 试剂：甲苯MUB(pH6.5缓冲溶液)：取200ml通用缓冲液至1000ml烧杯中，用0.1mol•L-1盐酸(大概要用450〜500ml)溶液调至pH6.5，用水定容至1L；或pH11缓冲溶液：用氢氧化钠(0.1mol.L-1)溶液调至pH11，用水定容至1L。通用缓冲液：称取6.05g三(羟甲基)氨基甲烷、5.8g丁烯二酸、7.0g柠檬酸和3.15g硼酸于244ml氢氧化钠溶液［C(NaOH)=1mol.L-1］中，然后用水稀释到500ml，低温贮存备用。0.1mol/L盐酸：吸取8.3ml浓盐酸溶于600ml中定容至1L。1mol/LNaOH溶液：取20gNaOH溶于300ml水中然后定容至500ml。对硝基苯磷酸二钠溶液(0.05mol•L-1)：称取4.63925g六水对硝基苯磷酸二钠或3.2881g无水对硝基苯磷酸二钠溶于150mlMUB(PH6.5或者11的缓冲溶液)，用同一种缓冲溶液稀释至250ml，低温贮存。0.5mol/LCaCl2溶液：称取27.385gCaCl2、6H2O溶解于150mL水中，用水定容到250ml。THAM-NaOH：称取12.2g的THAM溶于800ml蒸馏水中，用0.5mol/LNaOH溶液调节pH至12，再用蒸馏水定容至1L。（8）对硝基苯酚标准溶液：溶解1.0g对硝基苯酚于700ml水中，稀释至1L,低温保存。配置工作曲线用的溶液。将已经配置好的标准溶液用水稀释100倍，再分别吸取稀释后的标准溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml于50ml三角瓶中（分别含0mg、0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg的对硝基苯酚），分别用水调节至5ml，再加入1ml的CaCl2和4ml的NaOH溶液，轻摇几秒钟，滤纸过滤，400nm—420nm条件下比色。（二）测定方法称取壤土0.3g、砂土0.5g、粘土0.1g风十土于50mL离心管中，加入0.2mL甲苯和4mLMUB（MUB即通用缓冲液，pH=6.5），再加1mL0.05mol/L对硝基苯磷酸钠溶液（用MUB配），摇匀后加盖，放进36〜37°C的培养箱中进行培养1个小时；培养完成后取出加入0.5mol/L的CaCl21mL及THAM-NaOH4mL，摇匀；而后转入10mL塑料离心管中在2500r/min下离心5min；取上清液在410nm处比色，并记录吸收光值。土壤酸性磷酸酶测定（改进后）待测土样风干，过80目筛。精确称取0.500g土样（粘土0.200g）于10ml圆底塑料离心管中，加入0.2ml甲苯，振荡摇匀。15分钟后，加入4mlpH=6.5MUB，再加入1ml0.05M对硝基苯磷酸二钠溶液（以pH=6.5MUB配制），加盖摇匀，于37C培养1小时。取出后摇匀，加入1ml0.5M氯化钙溶液和4mlTHAM-NaOH溶液，振荡摇匀，于2500r离心5分钟。吸取上清液5ml，于3800r离心5分钟，于1小时内，在410nm下比色，记录光吸收值。（因为所有试剂加完后10ml离心管太满，盖盖时溶液容易溢出 ，对实验造成误差， 故将MUB溶液和THAM-NaOH溶液均调整为3.8ml。）标准曲线的绘制:精确称取0.2g对硝基苯酚，用水定容至100ml得到2mg/ml对硝基苯酚溶液，取5ml再次定容至50ml。则得到0.2mg/ml对硝基苯酚标准溶液。（或直接精确称取0.2g对硝基苯酚，用水定容至1000ml得到0.2mg/ml对硝基苯酚标准溶液）分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0ml对硝基苯酚标准溶液（吸取），对照组不吸取标准溶液，并定容至1ml，摇匀后加入4mlpH=6.5MUB、1ml0.5M氯化钙溶液和4mlTHAM-NaOH溶液，振荡摇匀，于2500r离心5分钟，再于3800r离心5分钟。于1小时内，在410nm下比色，记录光吸收值。以标准溶液浓度为横坐标，以光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。建议不用氢氧化钠做终止剂，有的时候氯化钙和碱性容易在空气中会有碳酸钙产生混浊影响测定。THAM调成ph12比较好。用氢氧化钠后，滤液不能放时间太久，其实对硝基苯酚很稳定，可以放一段时间，前提是不能裸露不封口造成挥发。三羟甲基氨基甲烷（英文名称：Tris；THAM）溶液可以从空气中吸收二氧化碳，使用时注意将瓶盖严。（四）计算方法土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中产生的对硝基苯酚的质量（mg）表示，磷酸酶活性=（a样品一a对照）Xn/（mXt）式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的对硝基苯酚的含量（/mg）；a对照为对照吸光值由标准曲线求得的对硝基苯酚的含量（/mg）；n为分取倍数（稀释倍数），浸出液体积/吸取滤液体积（未稀释或分取时值为1）;m样品土壤的重量（g）。t一反应时间（h）脱氢酶活性测定（一） 、原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲臆（TPF），TPF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。该方法以2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）为基质，基质接受脱氢酶活化的酚，生成红色的2,3,5-三苯基甲月替（TTF），该红色溶液在485nm处有最大的吸收光值，根据甲月替的生成数量与红色溶液的吸光度成正比来进行定量分析，采用的是TTC还原比色法。（二） 、试剂1） 0.5%葡萄糖溶液：250ml的溶液中含1.25g葡萄糖。2） pH7.6Tris-HCl缓冲液（0・05M）的配制：A：0.2M三-（羟甲基）-氨基甲烷溶液（250ml含6.057g）B：0.2MHCl（1.67ml浓盐酸稀释到100ml）100mlA+76.8mlB，准确调节pH为7.6，加水稀释至400ml。（125mlA+96mlB，准确调节pH为7.6，加水稀释并定容500ml62.5mlA+48mlB，准确调节pH为7.6，加水稀释并定容250ml）3） 2%TTC-Tris溶液：2gTTC溶于100mlpH7.6Tris缓冲液，避光保存于棕色试剂瓶保中，存放时间不得超过一周。（三） 、脱氢酶活性的测定（1）称取风干土样壤土0.5g、黏土0.5g、沙土1.0g于50ml的塑料离心管中，加入0.5ml0.5%的葡萄糖溶液，混匀，再加入0.2ml3%TTC溶液，混匀后在36-37摄氏度的培养箱中暗室培养24h。（称取4克鲜土于50ml三角瓶中，加入4mL（TTC-葡萄糖-Tris缓冲溶液（pH7.6，即2ml1%TTC-Tris缓冲溶液，2ml1%葡萄糖)，置37°C暗室培养24hr。)培养完成后，加2滴浓硫酸终止反应，再加入10ml甲醇，彻底混匀(盖上盖子，上下摇动)。而后转入10ml塑料离心管中在2500r/min下离心5min。取上清液在485nm下比色，记录吸收光值A485。、标准曲线的制作取一支大试管，用移液管移取0.2ml3%TTC溶液，再加入少量保险粉，摇匀，最后移取9.8ml甲醇溶液。试管内的混合液记为母液。取6支试管，按顺序编号，并按表4加入试剂。表4TTC标准曲线配制表试管号0123456600mg/mlTTF(ml)00.250.350.50.751.01.25TTF浓度(mg/ml)0152130456075甲醇(ml)109.759.659.59.259.08.75(3)混匀后，比色，以0号作为对照，在485nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A485。(4)以吸光值为横坐标，TTF的浓度为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R，即TTF浓度C(mg/L)=a+b*A485,通过计算得到回归方程为：C(mg/ml)=3.0605+75.4514*A485,R=0.9999,R2=0.9999(五)计算方法土壤脱氢酶的活性用每克土中的TTF的微克数表示，即(mg/hgW)=C*V*稀释倍数/(W*t)式中：C一标准曲线上查得样品中TTF浓度(mg/ml);V—样品反应的总体积(ml);t—反应时间(h);W一样品土壤的重量(g)。土壤脱氢酶测定(实验改进的)待测土样风干，过80目筛。精确称取0.500g土样于10ml圆底塑料离心管中，加入0.3ml0.5%葡萄糖溶液，振荡摇匀，再加入0.3ml2%TTC-Tris溶液，加盖摇匀，于37C培养24小时。取出后摇匀，滴加2滴浓硫酸(或0.1ml的甲醛)作为终止剂，再加入5ml甲醇，振荡摇匀，于2500r离心5分钟。于1小时内，在485nm下比色，记录光吸收值。TPF标准曲线的制备:准确称取50mgTPF溶于100ml甲醇中，得到500ug/ml的母液。从中吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0ml于10ml比色管中，用甲醇定容10ml，得到0，5，10，15，20，25，30，35，40,45,50ug/mlTPF的标准曲线。注意：脱氢酶显色后随时间延长色度明显降低，故应尽快测定其吸光度。有文献表明显色反应4小时候后反应液色度逐渐降低，反应2小时时显色液色度达到高峰。土壤蔗糖酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）一、 原理蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。二、 试剂1） 甲苯2） 酶促反应试剂：基质8%蔗糖溶液1L。（80g蔗糖溶于1000ml水中）3） pH5.5磷酸缓冲液：A液：1/15M磷酸氢二钠（5.969gNa2HPO4•12H2O溶于250ml蒸馏水中）B液1/15M磷酸二氢钾（4.536gKH2PO4溶于500ml蒸馏水中）0.5mlA液加9・5mlB液即成（用量200ml时10mlA液加190mlB液）3）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）称2・5g二硝基水杨酸，溶于100ml2mol/LNaOH（20gNaOH溶于250ml水中）和250ml水中，再加150g酒石酸钾钠，用水稀释定容至500ml（保存期不过7天）。注意：DNS一定要在配制结束后立即转移到小棕色瓶中，同时，使用过程中尽量减少与空气接触。DNS低温后易析出，故使用前要待其重新溶解后使用。4）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80°C烘箱内约12小时。准确称取100mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至100mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4°C保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。三、 操作步骤1、 称取0・5g风十土于10mL离心管中，加入0・1mL甲苯和1mLpH5.5磷酸缓冲液，再加3mL8%蔗糖溶液，摇匀后加盖，放进36〜37C的培养箱中进行培养24个小时；2、 培养完成后取出，摇匀，并于4000r/min离心5min；3、 取上层清液0.8ml于10ml玻璃管中，并加入2ml3,5-二硝基水杨酸试剂，再立即将玻璃管沸水浴中加热5min，加热完毕后在自来水流下冷却3min，溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙红色；4、 向离心管中加入5ml蒸馏水来稀释显色液体，在540nm波长下比色，记录吸光值（测定前注意震荡摇匀）。标准曲线的制作分别吸1mg/mL的标准葡糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL于试管中，再补加蒸馏水至0.8mL，加DNS试剂2mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起）取出立即冷水浴中冷却至室温，加热显色后再加入5ml蒸馏水稀释，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。标准葡糖溶液浓度可根据实验情况增大为2mg/mL或5mg/mL.四、 结果计算：蔗糖酶活性以24h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。蔗糖酶活性=（a样品一a无土一a无基质）Xn/ma样品、a无土、a无基质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数（取上层清液0.8ml时，n=5）；m表示烘干土重一般情况下，选取最大吸收峰处的波长进行测定可以提高灵敏度，但在此波长下DNS试剂也具有一定的吸光度（DNS试剂-水曲线）。再者，实验过程中，显色之前空白和待测液中DNS试剂的添加量是相同的，但显色期间由于部分DNS试剂与待测液中还原糖相结合，从而造成测定吸光度时，空白中DNS试剂含量大于待测液中DNS试剂含量。故500nm下，DNS试剂对测定结果十扰严重。结合葡萄糖显色液-水曲线可以看出，这种影响在久V540nm的情况下一直很显著。故本实验DNS试剂1最终确定的测定波长选为540nm，而不是500nm(最大吸收波长)。过氧化物酶活性测定过氧化物酶能氧化土壤中的有机物质，过氧化物酶酶促邻苯三酚氧化为醌，呈黄色，用乙醚提取生成紫色没食子素(没食子素就是邻苯三酚，紫色没食子素就是多酚氧化酶催化氧化没食子素生成的东西)。比色着色的乙醚相，该乙醚相在430nm处有最大光吸收值，采用的是邻苯三酚比色法。一、试剂1%邻苯三酚溶液:500ml溶液含5g邻苯三酚(又称焦性没食子酸C6H6O3)注意：此溶液为无色透明溶液，变色浑浊后不能继续使用。0.5%HO溶液：取4.17(4.20)mlHO试剂用水定容至250ml。22 22乙醚0.5mol/LHCL：取10.42ml浓盐酸溶于150水中，然后用水定容至250ml。PH4.5柠檬酸-磷酸缓冲溶液：0.1mol/L柠檬酸溶液：10.507gC6H7O8'H2O溶至500ml或5.2535gC6H7O8'H2O溶至250ml；。0.2mol/L磷酸氢二钠溶：53.63gNH2HPO4.7H2O或者71.7gNa2HPO4.12H2O溶至1L(35.814gNa2HPO4.12H2O溶至500ml)。取10.65ml柠檬酸和9.35mlNa2HPO4混匀(用量较多可以乘以倍数配制),之后再用这两种溶液调节PH即