新生儿疾病筛查技术

新生儿疾病筛查中心

新生儿疾病筛查技术进展北京妇幼保健院北京新生儿疾病筛查中心新生儿疾病筛查中心新生儿疾病筛查的意义

新生儿疾病筛查是指医疗保健机构在新生儿群体中，用快速简便敏感的检验方法，对一些危及儿童生命、危害儿童生长发育、导致儿童智能障碍的先天性疾病遗传代谢性疾病进行群体筛查，从而使患者在临床上未出现疾病表现，而其体内生化、激素水平已有明显变化时就做出早期诊断，及时有效地进行治疗，从而保证儿童正常的智能发育和体格发育新生儿疾病筛查中心筛查疾病的选择标准：

疾病危害严重，可导致残疾或致死。

疾病早期无特殊症状，但有实验室指标显示阳性。

有可靠的、适合大规模进行的筛查方法筛查的疾病可以治疗。特别是通过早期治疗能逆转或减慢疾病发展筛查费用低廉，成本效益较好新生儿疾病筛查中心新生儿疾病筛查的历史：新生儿疾病筛查概念的形成细菌抑制法的建立CH筛查方法的建立脐带血测定TSH新生儿末梢血T4测定干血滤纸片测定TSH

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“新生儿疾病筛查”概念的形成：

1934年挪威生化学家Folling首次报道PKU。1953年德国Bickel医生使用饮食疗法治疗PKU获得成功，并同时提出早诊断、早治疗的想法，设想尽早将患儿从正常人群中筛选出来。“新生儿疾病筛查”概念由此形成。新生儿疾病筛查中心新生儿疾病筛查在国外的研究情况

目前世界上已经有很多国家开展了新筛工作。对新筛的研究十分活跃，从1966年首届新生儿疾病筛查的国际会议在南斯拉夫召开，到现在已经召开了10余届。1993年在日本召开了第一届亚太地区新筛会议，今年9月在上海将召开第五届亚太地区新筛会议。新生儿疾病筛查中心新生儿疾病筛查的进展

筛筛查查疾技病术增改加进新生儿疾病筛查中心

筛查的疾病

1982年，在日本东京召开的第二届国际新生儿疾病筛查大会上提出了适合大规模筛查的四种疾病：PKU、CH、Gal、CAH。随着对遗传代谢病的深入了解和新的筛查技术的应用，又有一些疾病被列入筛查范围，如葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症、生物素酶缺乏（BDD）、酪氨酸血症、镰状红细胞贫血（SCD）、His、MSUD、HC、囊性纤维化（CF）等疾病。应用串联质谱可筛查包括氨基酸代谢异常、有机酸代谢异常和脂肪酸代谢异常约30种疾病。新生儿疾病筛查中心

筛查方法的改进：

半定量分析、定量分析放免方法、酶免疫方法、荧光免疫方法、时间分辨荧光免疫分析法、串联质谱技术、基因芯片技术等。筛查技术的重大突破是从“一种实验检测一种疾病”发展到“一种实验检测多种疾病”。

新生儿疾病筛查中心新生儿疾病筛查的现状

目前，全世界每年有数千万新生儿进行筛查，一些国家已经将新生儿疾病筛查列入国家卫生法，或者采用行政手段，使活产新生儿的筛查覆盖率接近100%。美国每年有400万婴儿接受新生儿疾病筛查。新生儿疾病筛查中心世界部分国家开展的新生儿筛查项目国家PKUCHGalCHACFBDDMSUDSCDHS其他

USA▲▲▲▲▲▲▲▲▲

日本▲▲▲▲▲▲新西兰▲▲▲▲▲▲▲意大利▲▲▲▲▲▲▲巴西▲▲▲▲▲▲▲▲▲

阿根廷▲▲▲▲▲▲▲奥地利▲▲▲▲▲▲▲

德国▲▲▲▲▲▲▲▲▲比利时▲▲▲▲▲▲▲▲英国▲▲▲法国▲▲▲丹麦▲▲▲瑞士▲▲▲▲▲

新生儿疾病筛查中心部分亚洲国家开展的新筛项目国家或地区筛查疾病开始时间

中国PKU、CH、G6PD#、CAH#

1981中国台湾PKU、CH、CAH、Gal、G6PD、HC、（MS/MS）1981中国香港CH、G6PD1984日本PKU、CH、CAH、Gal、MSUD、HC、（MS/MS）70年代初韩国PKU、CH、MSUD、Gal、His、HC、（MS/MS）1991菲律宾CH、PKU、CAH、G6PD1996泰国CH、PKU1996新加坡CH、G6PD1965越南CH1998蒙古CH2000

新生儿疾病筛查中心中国新生儿疾病筛查的状况

我国的新生儿疾病筛查开始于80年代，1994年颁布的《中华人民共和国母婴保健法》第24条明确提出要“逐步开展新生儿疾病筛查、婴儿多发病和常见病防治等医疗保健服务”，将新生儿疾病筛查第一次写入母婴保健法。新生儿疾病筛查这项工作得到了政府的重视，2001年6月20日国务院公布了《中华人民共和国母婴保健法实施办法》，新生儿疾病筛查的推广和提高是其中的重要内容。新生儿疾病筛查中心

截止到1998年，我国已经在16个省建立了18个新生儿疾病筛查中心。大多数筛查中心筛查的疾病是PKU和CH，无锡、上海和南京增加了先天性肾上腺皮质增生的筛查。其中上海筛查了50600个新生儿，筛出3例21羟化酶缺乏的患者，发病率为1：16866。广东、广西增加了葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症的筛查。G6PD是一种红细胞酶的缺陷病，在广东、广西、云南、四川发病率较高，据统计广州的发病率是3.6%，湛江地区发病率为4.6%。

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为保证新筛工作能够高质量顺利的完成，以下三个方面是必不可少的：1。强大健全的筛查网络2。严格准确的筛查实验3。及时追踪、治疗、随访患者新生儿疾病筛查中心强大健全的筛查网络

新生儿疾病筛查属于预防医学的范畴旨在早期确认患某种特定遗传代谢性疾病的患儿，它是遗传学实验渗入到预防医学的标志。新生儿疾病筛查必须在各级卫生行政部门的支持领导下纳入预防医学发展规划中，制定相关的政策、法规，建立良好的筛查管理网络，强化机构、人员许可制度，才能保证标本及时地采集、递送、随访，并建立有效的监督评价机制。利用各种卫生宣传活动，孕妇学校，张贴宣传新筛意义的相关资料，对孕妇、新生儿的父母、医护人员进行宣传教育，使之认识到新生儿疾病筛查的重要性和必要性。新生儿疾病筛查中心严格准确的筛查实验

新生儿疾病筛查实验绝非仅指新筛实验室具体的标本测定过程，而是一个包括多个环节的全过程。新筛是在患者未出现症状之前，通过实验检查把患者筛选出来。因此，对疾病诊断的唯一依据就是实验结果，这与通常进行的临床检验项目意义显然不同。筛查结果显示阳性，就能把患儿筛选出来，如果实验结果是假阴性，就会出现漏诊。新生儿疾病筛查中心新生儿筛查的技术路线

标本的采集标本的运输标本登记编号标本的分析结果分析

治疗随访新生儿疾病筛查中心标本的采集1.手套和采血针的选择:手套无滑石粉、每一个新生儿更换一个。采血针要能够控制穿刺深度，<3mm2.采血人员的要求：经过正规培训考核合格的固定人员，严格掌握采血时间、足跟部位、方法、合格血片的标准、正确填写采血卡片的内容，并要执行签名制度。采血的质量直接影响到筛查实验的正确性。3.采血卡片的填写：4.采血登记：新生儿疾病筛查中心5.采集时间：对于苯丙酮尿症，在无蛋白质负荷或少蛋白质负荷时，血中苯丙氨酸含量较低，实验结果可能出现假阴性。生后72小时采血，既可以保证新生儿吃足母乳，又可以避过TSH生理性高峰期。6.标本保存和递送：标本叠放时应将血斑交替隔开放置，避免两张卡片的血斑相互污染，冰箱放置，7天左右送到新筛中心。新生儿疾病筛查中心实验室分析新生儿疾病筛查常用技术和方法

苯丙酮尿症筛查方法

细菌抑制法

酶法

荧光分析法

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细菌抑制法（bacterialinhibitionassayBIA)

1961美国Guthrie医生建立了细菌抑制法，是苯丙氨酸半定量测定法，具有灵敏、简便、重复性好、经济、不需要特殊设备，适合于大规模群体筛查等优点。19621963年，用此方法在美国进行了40万新生儿筛查，发现患者20多人，并进行了早期治疗。

新生儿疾病筛查中心实验原理

枯草杆菌变异菌株(bacillussubtilisAATT6633)的生长需要苯丙氨酸存在。若在培养基中加入苯丙氨酸的抑制剂-2噻吩丙氨酸后，细菌的生长受到抑制，-2噻吩丙氨酸对枯草杆菌的生长抑制作用可因外界加入苯丙氨酸得到解除。所以在含有适当比例枯草杆菌和-2噻吩丙氨酸的培养平板上，将含有新生儿血滴的干血滤纸片放入培养板上，标本上的苯丙氨酸渗入周围培养基中，经过37℃孵育过夜，如果苯丙氨酸存在过量，新生儿疾病筛查中心由于其竞争抑制使细菌恢复了生长。细菌环直径的大小与苯丙氨酸的浓度成正比。根据生长环直径的大小与已知量的标准菌环直径比较，即可得出样品中苯丙氨酸的含量。

仪器和材料

仪器：3mm直径打孔器、37℃恒温培养箱、超净工作台等新生儿疾病筛查中心材料：枯草杆菌ATCC6633芽孢悬液、

0.5mmol/L-2噻吩丙氨酸、苯丙氨酸标准滤纸片、

10xDemain’s营养液、青霉素酶

新生儿疾病筛查中心操作步骤培养板的制备：1.5g琼脂加135ml蒸馏水，加热溶解，自然冷却至60~65℃后加入：

10xDemain’s营养液15ml

抑制剂1.5ml

枯草杆菌0.25ml青霉素酶0.15ml充分混匀到入培养板，备用。

新生儿疾病筛查中心加样：用3mm直径的打孔器打下标准血片、质控血片和待测血标本，用镊子将血片放在相应的编号上。

孵育和观察：将培养板放入37℃恒温培养箱过夜，次日取出，量取标准和待测血标本细菌生长环直径，通过标准曲线的回归方程，计算标本中苯丙氨酸的含量。新生儿疾病筛查中心结果判断：凡血苯丙氨酸浓度>切值的标本，均先进行原标本复查，再招回新生儿进一步取样复查，进行苯丙氨酸定量分析，以便确诊。新生儿疾病筛查中心荧光测定法荧光法是定量测定苯丙氨酸的一种方法。该方法灵敏度高，商品化试剂盒的检测低限为0.5mg/dl。当血胆红素<200mol/L时，对实验结果无干扰。通过严格控制pH值可最大程度控制其他氨基酸的干扰。新生儿疾病筛查中心

实验原理

苯丙氨酸与茚三酮反应，形成荧光化合物，在反应体系中加入二肽L-亮氨酸-L-丙氨酸可提高荧光反应，用琥珀酸盐缓冲液严格控制反应条件，pH值在5.8±0.1可保证理想的荧光值和最大的特异性。加入铜试剂稳定荧光复合物并终止反应。

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仪器和材料仪器：荧光读数仪自动洗扳机振荡仪3mm打孔器加样器新生儿疾病筛查中心材料：商品化试剂盒，包括茚三酮、L-亮氨酸-L-丙氨酸、琥珀酸盐缓冲液、铜试剂、标准品、质控品、酶标板等。新生儿疾病筛查中心操作步骤1.用3mm打孔器分别将标准品、质控品、待测血标本打下，依次放入酶标板内。2.每孔加入80l的80%乙醇，室温振荡30分钟，900转/分。3.转移50l洗脱液至另一块酶标板。4.加50l反应混合液，振荡1分钟后，37℃温育2小时。新生儿疾病筛查中心5.每孔加200l冷的铜试剂，冷却反应混合物至室温。6.室温放置15分钟。7.加入铜试剂后15~30分钟内，在波长485nm处，测定每孔的荧光强度。结果判断

可用电脑酶标工作软件，自动绘制标准曲线，计算标本的苯丙氨酸浓度。新生儿疾病筛查中心干血滤纸片促甲状腺激素的测定方法

酶免疫分析法荧光酶免疫分析法时间分辨荧光免疫分析法新生儿疾病筛查中心

酶免疫分析法

又称为酶联免疫吸附分析法（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。酶免技术是以酶标记抗体或抗原作为主要试剂，与标本中待测的相应抗原或抗体反应后，通过标记物的放大作用，检测出标本中的待测物质。该方法的特点是具有高度的特异性和敏感性。新生儿甲低的筛查使用的是双抗体夹心法测定干血滤纸片中的抗原hTSH浓度。新生儿疾病筛查中心原理

利用固相反应板包被抗hTSH抗体，成为固相抗体反应板，加入直径3mm的被测定的干血滤纸片、标准干血滤纸片、质控干血滤纸片和酶标记抗体液（辣根过氧化物酶，hTSH-HRP),通过一定时间的反应，由于两种单克隆抗体所抗hTSH相位上的不同，在反应体系中，从干血滤纸片、标准干血滤纸片、质控干血滤纸片中溶出的hTSH都能与固相抗体和酶标记抗体同时结合，形成双抗体夹心抗原hTSH的复合物。待反应稳新生儿疾病筛查中心定后，滤纸片和血液中的其他成分以及游离的过量酶标记抗体经洗涤而被去除，此时反应体系中被测物质的含量与酶成一定的比例关系，然后加入酶作用的底物，经酶对底物一定时间的催化作用，使底物变成可测定的产物，最后通过酶标仪读出产物的吸收值。此读数的高低与被测物TSH的含量成正比。通过与在同等条件下测得的标准值比较由绘制的标准曲线计算出未知标本中hTSH的含量。新生儿疾病筛查中心试剂和材料1.试剂盒的组成：包被抗hTSH抗体的96孔固相反应板、酶标记的抗hTSH抗体复合物、酶反应底物（四甲基联苯胺TMB）、显色剂稀释液、标准干血滤纸片1套、终止液等。2.仪器：酶标读数仪（配备电脑）、振荡仪、洗扳机、打孔器、自动多道可调移液器等。新生儿疾病筛查中心串联质谱结果分析遗传代谢病是由于人体内某些酶生物合成发生障碍，引起体内毒性中间代谢产物积累或必需代谢物的缺乏，在血液中表现为相应代谢物如氨基酸、乙酰肉碱的含量增高。串联质谱是通过计算离子率，即代谢物的丰度与相应内标丰度之比，然后在预先建立的标准曲线上将比率转换成浓度，以诊断相应的遗传代谢缺陷病。新生儿疾病筛查中心串联质谱筛查的氨基酸代谢病（16种）苯丙酮尿症（PKU）枫糖尿症（MSUD）同型胱氨酸尿症（homocystinuria)酪氨酸血症I型、II型，暂时性酪氨酸血症组氨酸血症高甲硫氨酸血症非酮性高血糖症高脯氨酸血症I型、II型高鸟氨酸血症瓜氨酸血症精氨琥珀酸尿症精氨酸酶缺乏磷酸氨甲酰合成酶缺乏

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串联质谱筛查的有机酸代谢紊乱病（13种）

丙酸血症异戊酸血症戊二酸血症I型、II型甲基丙二酸血症甲基丙二酸辅酶-A变异酶缺乏症

新生儿疾病筛查中心串联质谱筛查的脂肪酸氧化缺陷病（10种）

短链乙酰辅酶A脱氢酶缺乏症中链乙酰辅酶A脱氢酶缺乏症长链乙酰辅酶A脱氢酶缺乏症极长链乙酰辅酶A脱氢酶缺乏症长链羟化乙酰辅酶A脱氢酶缺乏症肉碱棕榈油酰合成酶缺乏症肉碱棕榈油酰转移酶缺乏症肉碱转运体缺乏症2,4二烯酰辅酶A还原酶缺乏症肉碱/乙酰肉碱转位酶缺乏症新生儿疾病筛查