临床八年制生物化学教案-重组DNA技术

临床八年制生物化学教案重组DNA技术教学要求：掌握基因重组（重组DNA）和重组DNA技术的概念。熟悉重组DNA技术的基本原理。了解重组DNA技术与医学的关系。课时安排：总学时4.0第一节重组DNA技术概述1.0第二节重组DNA技术常用分子工具2.0第三节DNA克隆0.5第四节克隆DNA的相关分析0.5重点：自然界的基因转移和重组重组DNA技术的基本原理及步骤难点：重组DNA技术的基本原理教学内容：一、重组DNA技术概述1．重组DNA技术又称为DNA克隆或分子克隆（1）“克隆”就是获得遗传背景完全相同的分子或个体的“拷贝”（2）分子（DNA）克隆可以产生大量相同的DNA分子2．重组DNA技术是在体外利用酶对DNA进行重组的操作二、重组DNA技术常用分子工具1．工具酶在重组DNA技术中具有特殊的用途（1）限制性内切酶是重组DNA重要的工具酶（2）连接酶可将具有配伍末端的DNA片段共价连接（3）构建重组DNA分子还需要其它工具酶2．克隆载体可容纳外源DNA且具有自我复制能力（1）克隆载体应符合基因操作的要求（2）质粒是基因工程中应用最广泛的载体（3）λ噬菌体DNA是构建文库常用的载体（4）粘粒是一种可容纳较大DNA片段的融合载体（5）病毒DNA是用于动物细胞中研究的常用载体（6）可在不同宿主细胞中应用的载体称穿梭载体（7）细菌人工染色体可容纳达200kb的DNA片段（8）酵母人工染色体可容纳达500kb的DNA片段3．宿主细胞为重组的DNA分子提供扩增、筛选和表达的场所三、DNA克隆1．DNA克隆的核心过程是构建重组DNA分子（1）构建重组载体产生DNA杂合分子（2）重组分子可通过扩增、筛选与分离鉴定而获得2．利用重组DNA技术可分离、克隆单个基因（1）候选基因有染色体DNA和cDNA两种来源（2）利用核酸杂交从全基因组DNA文库中获取目的基因（3）利用分子探针筛选cDNA文库可分离特异编码序列（4）某些转录因子的编码基因可通过特异杂交系统被克隆四、克隆DNA的相关分析1．通过限制性作图初步了解DNA的序列信息2．DNA测序是了解DNA序列信息最首要的工作3．利用生物信息学技术对已测定的序列信息进行分析、综合和储存（1）确定克隆的开放阅读框可了解编码蛋白质的信息（2）利用计算机程序确定外显子/内含子边界（3）通过数据库搜索确定启动子和转录因子结合位点（4）通过数据库搜索确定蛋白质基序和结构域（5）应用网络序列比对搜索工具进行核苷酸和/或蛋白质序列比对4．分子杂交与印迹技术检测特异基因的存在或表达（1）Southern印迹检测目的DNA在基因组中的存在（2）Northern印迹检测目的基因在组织的特异性表达（3）检测特异基因存在或表达还有许多其他方法五、重组DNA技术在生物学及医学中的应用1．克隆的基因可表达具有生物活性的蛋白质2．基因定点突变技术可用于蛋白研究或改造蛋白质3．RNA干扰导致基因沉默可研究基因的功能4．转基因和基因打靶是研究基因功能的重要技术5．重组DNA技术加速了基因工程药物与疫苗的开发6．医学中应用重组DNA技术进行基因诊断与基因治疗中、英文专业词汇：clone克隆restrictionendonuclease,RE限制性内切核酸酶cloningvector克隆载体plasmid质粒multiplecloningsites,MCS多克隆位点polymerasechainreaction,PCR聚合酶链式反应transformation转化transfection转染transduction转导cDNA互补DNAgenomiclibrary基因文库probe探针openreadingframe,ORF开放阅读框insituhybridization原位杂交fluorescenceinsituhybridization,FISH荧光原位杂交RNAinterference,RNAiRNA干扰smallinterferingRNA,siRNA小干扰RNAgeneknock-out基因敲除genetherapy基因治疗思考题：简述基因工程的基本条件和基本过程。举例说明基因工程在工业、农业和医学中的应用。参考书：1．JeremyM.Berg,JohnL.Tymoczko,LubertStryer.Biochemistry.6thed.NewYork:W.H.Freeman,2007.2．RobertH.GlewandMiriamD.Rosenthal.Clinicalstudiesinmedicalbiochemistry.3rded.NewYork:OxfordUniversityPress,2007.3．DavidL.Nelson,MichaelM.Cox.LeningerP